賈麗艷 田宇敏 王曉勇 耿添霈 韓 英

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷030801 3 山西杏花村汾酒廠股份有限公司 山西汾陽032209）

傳統(tǒng)清香型白酒獨特的釀造技藝及微生物菌群結(jié)構(gòu)，協(xié)同優(yōu)質(zhì)的高粱、大麥和豌豆，共同造就了其獨特的風(fēng)格。傳統(tǒng)清香型白酒生產(chǎn)包括大楂發(fā)酵和二楂發(fā)酵2 個階段[1]。大楂和二楂酒醅的理化指標(biāo)不同[2]，必將影響酒醅中微生物的菌群結(jié)構(gòu)；而酒醅中理化指標(biāo)、微生物菌群結(jié)構(gòu)不同，又會影響白酒的風(fēng)味。研究酒醅發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，對于白酒發(fā)酵過程中功能性菌株挖掘及白酒品質(zhì)的提升具有重要意義。

目前，科研工作者采用微生物純培養(yǎng)或非培養(yǎng)技術(shù)對清香型白酒發(fā)酵過程中的微生物菌群進(jìn)行研究[3-11]。王薇等[9]采用傳統(tǒng)微生物分離方法，分析了清香型白酒固態(tài)釀造過程中酵母種群結(jié)構(gòu)和多樣性；韓莎等[10]研究了汾酒可培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)與代謝規(guī)律。然而，采用非培養(yǎng)技術(shù)對傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化規(guī)律的研究鮮有報道。本研究利用高通量測序技術(shù)系統(tǒng)研究傳統(tǒng)清香型白酒大楂和二楂發(fā)酵過程中真菌的動態(tài)演替規(guī)律，以確定清香型白酒發(fā)酵過程中真菌優(yōu)勢群體，為白酒生產(chǎn)的可調(diào)控化及生產(chǎn)技術(shù)升級奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2015年5月至6月，于某清香型白酒廠采集樣品。樣品包括大楂發(fā)酵0，3，7，10，15，17，21，23，28 d 和二楂發(fā)酵0，3，7，10，15，21，23，28 d 的酒醅，樣品編號分別以發(fā)酵時間標(biāo)記，共17 個樣本。樣品采集使用多點取樣法[3]。

1.2 主要試劑與儀器

dNTPs、DNA Marker，大連寶生物；Taq DNA polymerase、溶菌酶，美國Sigma 公司；N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺，北京Solarbio 公司；蛋白酶K，德國Merck 公司。

5430 高速冷凍離心機(jī)、5427 R 臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；MX-S 型可調(diào)式混勻儀，北京大龍公司；Bio-Best 200E 型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Siemon 公司；My Cycler 型PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；SpectraMax Drop 核酸蛋白微量檢測儀，美國Molecular Devices 公司；Miseq 測序儀，美國Illumina 公司。

1.3 樣品總DNA 提取及高通量測序

采用倪崢飛[12]描述的方法提取酒醅中的總DNA。Illumina MiSeq 測序由上海生工公司完成。采用關(guān)統(tǒng)偉等[13]描述的方法對所測樣品進(jìn)行α，β多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序結(jié)果

從大楂和二楂樣品中分別獲得18S rRNA 基因序列503 566 條和655 392 條，過濾掉低質(zhì)量的序列，獲得有效序列488 956 條和642 670 條；在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU，共產(chǎn)生14 230，7 303 個OTU。

2.2 樣品間α 多樣性分析

覆蓋率、香農(nóng)指數(shù)、Chao1 指數(shù)、辛普森指數(shù)等指標(biāo)可反應(yīng)樣品的α 多樣性[13]。由表1可知，大楂樣品序列覆蓋率在0.98～1 之間變化，表明各樣品文庫的覆蓋率較高；豐富度指數(shù)呈低-高-低-高-低的變化趨勢，表明各樣品真菌多樣性不同，在發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化；香農(nóng)指數(shù)在1.94～3.55之間波動變化，也表明不同發(fā)酵階段微生物的多樣性在變化。大楂發(fā)酵過程中真菌多樣性呈動態(tài)變化，發(fā)酵0～3 d，真菌菌群多樣性降低；3～10 d，真菌多樣性略有升高；10～17 d 又略有降低；17～21 d 又升高；21～28 d 先降低后略升高，表明大楂發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)在不斷變化。

表1 大楂各樣品真菌α 多樣性統(tǒng)計Table 1 Alpha diversity of fungi in different samples of Dacha

由表2可知，二楂樣品覆蓋率在0.99～1 之間變化，表明各樣品文庫的覆蓋率高；豐富度指數(shù)呈低-高-低-高-低-高的變化趨勢，表明各樣品真菌多樣性在發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化。與大楂相比，菌群多樣性變化規(guī)律略有不同。香農(nóng)指數(shù)在1.56～2.26 之間波動變化，表明二楂發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化，且多樣性變化趨勢小于大楂。

表2 二楂各樣品真菌α 多樣性統(tǒng)計Table 2 Alpha diversity of fungi in different samples of Ercha

2.3 樣品間β 多樣性分析

β 多樣性可反映不同環(huán)境中物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率。采用主坐標(biāo)分析法（PCoA）可直觀顯示樣品間β 多樣性。由圖1a可知，主成分1（P1）和主成分2（P2）的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到70.2%和17.5%，合計87.5%，是造成差異的主要來源。圖1b是P1 和P2 主成分分析二維散點圖，圖中不同的點代表不同的樣本，樣本間相似度越高，空間距離越近；反之，空間距離越遠(yuǎn)。由圖1b可知，各樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)具有一定差別，表明大楂酒醅發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化。

圖1 大楂各樣品真菌PCoA 分析散點圖Fig.1 PCoA results of fungi communities from the samples of Dacha

由圖2a可知，主成分1（P1）和主成分2（P2）的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到75.8%和12.6%，合計88.4%，是造成差異的主要來源。圖2b是P1 和P2 主成分分析二維散點圖。由圖2b可知，各樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)具有一定的差別，表明二楂酒醅發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化。

圖2 二楂各樣品真菌PCoA 分析散點圖Fig.2 PCoA results of fungi communities from the samples of Ercha

2.4 樣品間門水平的真菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用RDP classifier 對各樣品中的OTU 進(jìn)行分類信息分析，發(fā)現(xiàn)大楂、二楂在亞門或綱水平上，分別有26 個亞門或綱的真菌和未分類單元，主要為子囊菌綱、擔(dān)子菌亞門、接合菌亞門。由圖3可知，大楂發(fā)酵階段，子囊菌綱是優(yōu)勢種群，占到各時期真菌種群的10.58%～83.56%；在發(fā)酵0 d，子囊菌綱僅占該時期真菌種群的10.58%；發(fā)酵0～15 d 子囊菌綱所占比例越來越高，最高達(dá)到83.56%；發(fā)酵15 d 以后，子囊菌綱所占比例降低。

由圖4可知，二楂在發(fā)酵階段，子囊菌綱是優(yōu)勢種群，占到各時期真菌種群的52.88%～74.3%；在發(fā)酵0～3 d，子囊菌綱所占比例升高；發(fā)酵3～15 d 子囊菌綱所占比例略有升高；發(fā)酵15 d 后先降低后升高。與大楂相比未分類真菌在二楂發(fā)酵過程中占比較高，且在發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化。

2.5 樣品間屬水平的真菌群落分布

通過高通量測序，從大楂樣品中獲得185 個屬水平真菌。屬水平的真菌群落組成比例較高的前10 個屬分別是腹膜孢酵母屬、酵母屬、假絲酵母屬、橫梗霉屬、根霉屬、毛霉屬、球腔菌屬、曲霉屬、毛殼菌屬和其它未分類單元。圖5反映了大楂發(fā)酵過程中屬水平真菌群落組成情況。腹膜孢酵母屬、酵母屬、假絲酵母屬在酒醅發(fā)酵過程中相對含量較高，呈動態(tài)變化，推測它們是大楂發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，且在酒醅發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化。

從二楂樣品中獲得185 個屬水平真菌。測序結(jié)果中組成比例較高的前10 個屬分別是腹膜孢酵母屬、有孢漢遜酵母屬、有孢圓酵母屬、哈薩克斯坦酵母、隱囊菌屬、青霉屬、曲霉屬、Vanderwaltozyma、Pleospora 和其它未分類單元等。圖6反映了二楂發(fā)酵過程中屬水平真菌群落組成情況。腹膜孢酵母屬在發(fā)酵過程中相對含量呈逐漸降低的趨勢。

圖3 大楂樣品真菌在亞門或綱分類水平上的分布Fig.3 Distribution of fungi communities on samples of Dacha in subphylum or class level

圖4 二楂樣品真菌在亞門或綱分類水平上的分布Fig.4 Distribution of fungi communities on samples of Ercha in subphylum or class level

圖5 大楂樣品真菌在屬分類水平上的分布Fig.5 Distribution of fungi communities on samples of Dacha in genus level

圖6 二楂樣品真菌在屬分類水平上的分布Fig.6 Frequence of fungi communities on samples of Eacha in genus level

3 討論

本研究采用高通量測序技術(shù)完成了傳統(tǒng)清香型白酒大楂和二楂全發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果顯示傳統(tǒng)清香型白酒大楂和二楂真菌群落組成豐富，在發(fā)酵過程中真菌的種類和數(shù)量隨著發(fā)酵時間的延長和環(huán)境的改變不斷變化。其中子囊菌綱的腹膜孢酵母屬、酵母屬、假絲酵母屬、有孢漢遜酵母屬和有孢圓酵母屬等為大楂或二楂發(fā)酵主要優(yōu)勢菌。腹膜孢酵母屬在酒醅發(fā)酵過程中均具有一定含量且動態(tài)變化；特別是在二楂發(fā)酵過程中，呈逐漸降低的變化趨勢；酵母屬在大楂和二楂酒醅發(fā)酵過程中均呈升高-降低-再升高-再降低的動態(tài)變化趨勢。有孢圓酵母屬主要存在于二楂的酒醅中，且相對含量在酒醅中動態(tài)變化。這些菌體在酒醅中的作用及相互關(guān)系在未來研究中需要結(jié)合代謝組學(xué)、傳統(tǒng)微生物分離篩選及性能測定等技術(shù)手段和方法進(jìn)一步闡明，以便于更好地闡釋傳統(tǒng)清香型白酒的釀造機(jī)理，為清香型白酒的技術(shù)升級提供服務(wù)。此外，在大楂和二楂酒醅的高通量測序過程中還檢測到一些諸如根霉屬、毛霉屬的霉菌DNA。童敏江[14]研究發(fā)現(xiàn)，利用傳統(tǒng)釀造技術(shù)僅可以在清香型白酒生產(chǎn)用大曲及大楂發(fā)酵的初期分離到根霉、毛霉等霉菌，然而在酒醅其它發(fā)酵階段均檢測不出，表明這些菌體在酒醅中不生長繁殖，之所以在發(fā)酵后期能夠檢測到相關(guān)DNA，可能是由于這些真菌的DNA 在酒醅發(fā)酵過程中沒能及時完全分解導(dǎo)致。其它菌體DNA 也不排除具有以上現(xiàn)象。為此，在后期的研究中應(yīng)將高通量測序技術(shù)和傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法相結(jié)合，研究清香型白酒發(fā)酵過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)演替變化規(guī)律，根據(jù)酒醅發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境和不同微生物生物學(xué)特征，建立適合于清香型白酒酒醅中不同微生物分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以便充分客觀地了解清香型白酒中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，挖掘出更多酒醅發(fā)酵過程中的功能性菌株。

4 結(jié)論

通過Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)，對傳統(tǒng)清香型白酒大楂和二楂全發(fā)酵過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)、豐度及演替規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明大楂和二楂真菌群落組成豐富，在發(fā)酵過程中真菌的種類和數(shù)量隨著發(fā)酵時間的延長以及環(huán)境的改變而不斷變化，其中子囊菌綱的腹膜孢酵母屬、酵母屬、假絲酵母屬、有孢漢遜酵母屬和有孢圓酵母屬等為大楂或二楂發(fā)酵的主要優(yōu)勢菌。