張傳藝，黃桂紅

【摘要】目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討異槲皮苷改善胰島素抵抗相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用及其作用機(jī)制。 方法：通過TTD（Therapeutic Target Database）、swiss Target Prediction以及PubChem數(shù)據(jù)庫找出異槲皮苷單成分基因靶點(diǎn)，再通過DisGeNET、Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫設(shè)置篩選條件，優(yōu)選分?jǐn)?shù)及相關(guān)性高的胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，利用Venny軟件找到異槲皮苷與胰島素抵抗的共同靶點(diǎn);利用STRING、DAVID、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析及富集（GO）分析和KEGG pathway分析;通過Cytoscape軟件構(gòu)建異槲皮苷改善胰島素抵抗的“單成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果：檢索異槲皮苷基因靶點(diǎn)114個(gè)，檢索胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)經(jīng)篩選獲取563個(gè)，異槲皮苷和胰島素抵抗的共同靶點(diǎn)24個(gè)，其中核心靶點(diǎn)18個(gè)，預(yù)測(cè)核心靶點(diǎn)INSR、PI3K、AKT2、GSK-3為關(guān)鍵靶基因在 PI3K -Akt、mTOR、胰島素抵抗、糖尿病心肌病等信號(hào)通路上參與糖異生途徑、糖代謝、脂質(zhì)代謝、抗炎等生物過程來發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用[1]。結(jié)論：異槲皮苷通過多靶點(diǎn)、多通路構(gòu)建“單成分-靶點(diǎn)-通路”的機(jī)制改善胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展，為未來研究異槲皮苷影響關(guān)鍵靶基因在信號(hào)通路上mRNA和蛋白表達(dá)作用奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) 異槲皮苷 胰島素抵抗 作用機(jī)制

【中圖分類號(hào)】R587.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.

異槲皮苷（isoquercitrin， IQ）又名羅布麻甲素 ，屬于黃酮醇類化合物，廣泛存在于砂仁、桑葉、羅布麻等多種藥用植物當(dāng)中 ，也可人工合成。異槲皮苷作為藥用植物的有效成分具有許多藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂等[2]。異槲皮苷具有較大的藥用價(jià)值和應(yīng)用前景，值得深入開發(fā)研究。單一成分的化學(xué)藥物可能特異性地作用于受體蛋白、生物膜通道、跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等多個(gè)不同類型的靶點(diǎn)。中藥的復(fù)雜體系，使中藥小分子與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系更加復(fù)雜。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從基因、分子水平去分析多種藥物分子作用于不同靶點(diǎn)、細(xì)胞和器官的生物學(xué)行為，能系統(tǒng)地預(yù)測(cè)和揭示不同藥物分子的作用及機(jī)制，幫助人們分析藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，更全面地了解藥物治療作用與疾病病理基礎(chǔ)。[3]

現(xiàn)已有部分關(guān)于異槲皮苷通過影響某些信號(hào)通路上的基因靶點(diǎn)而改善某些疾病的報(bào)道，如異槲皮苷可抑制ERK激酶（MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子1（Nrf1）表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病腎?。―N）腎臟纖維化的修復(fù)[4]。又如異槲皮苷有誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與對(duì)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中相關(guān)因子的干預(yù)有關(guān)[5]。一方面，本研究可以運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提前構(gòu)建出這些基因靶點(diǎn)的理論模型，為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證節(jié)約時(shí)間;另一方面，為未來更深入研究異槲皮苷可激活胰島素抵抗等疾病相關(guān)信號(hào)通路上關(guān)鍵靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)等作用延展實(shí)驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1材料

TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet. org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim. org）、Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）、DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html）、 Cytoscape作圖軟件。

1.2方法

1.2.1異槲皮苷靶點(diǎn)的篩選

利用TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及 PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）找到異槲皮苷的基因靶點(diǎn)并進(jìn)行匯總。

1.2.2胰島素抵抗靶基因的篩選

利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）輸入關(guān)鍵詞“insulin resistance”查找胰島素抵抗發(fā)病基因，分別下載，其中篩選條件設(shè)置為：DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）優(yōu)選胰島素抵抗分?jǐn)?shù)≥0.1，Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）優(yōu)選胰島素抵抗相關(guān)性≥20，最后將三個(gè)數(shù)據(jù)庫中的所有基因整理匯總，作為胰島素抵抗的疾病靶基因。

1.2.3成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），針對(duì)異槲皮苷有效靶點(diǎn)和胰島素抵抗靶基因取交集，找到異槲皮苷和胰島素抵抗的共有基因靶點(diǎn)，得到相應(yīng)名稱和個(gè)數(shù)。

1.2.4 PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析（Protein-Protein Interaction，PPI）

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string- db.org/），在“Multiple proteins”一欄輸入共同靶點(diǎn)基因名稱，選擇人源基因（Homo sapines），得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做圖，同時(shí)設(shè)置最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)條件為 0.900及以上，得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析圖，找出關(guān)鍵基因，再作圖進(jìn)一步分析。

1.2.5富集（GO）分析和KEGG分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇“start Analysis”，在step1中輸入異槲皮苷和胰島素抵抗關(guān)鍵靶點(diǎn)，接著在step2中的“選擇鑒別”一欄中選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，同時(shí)在step2a中設(shè)置篩選條件中種屬選擇智人（homo sapiens），在step3中選擇基因列表。在“Functional Annotation Tool ”功能注釋中僅勾選“Gene_Ontology ”中的“GOTERM_BP_DIRECT”、“GOTERM_CC_DIRECT”和“GOTERM_MF_DIRECT”以及“Pathways”中的“KEGG_PATHWAY”得到可視化表格并進(jìn)行下載。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html），在“KEGG mapping” 里找到“KEGG mapper”，點(diǎn)開進(jìn)入，找到“Search&Color Pathway （and Brite， Module）”，輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)，篩選條件是種屬為人，即選擇“homo sapience pathway”。選擇靶點(diǎn)數(shù)量較多出現(xiàn)在通路圖上的進(jìn)行分析，著重分析與胰島素抵抗相關(guān)的通路和通路上的靶點(diǎn)。

1.2.6 藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病Cytoscape作圖可視化分析利用Cytoscape作圖軟件繪制異槲皮苷和胰島素抵抗“單成分藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系驗(yàn)證異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1異槲皮苷單成分靶點(diǎn)

通過TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及 PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）找到異槲皮苷的基因靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，其中TTD數(shù)據(jù)庫在“target”結(jié)果中搜索出2個(gè)靶基因，分別為“AKR1B1、ACE”;Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫畫出異槲皮苷分子式圖，如圖1，搜索出“target”對(duì)應(yīng)的基因名稱“common name”下載;PubChem數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果見“BioAssay Results’中的“target name”，篩選“active”基因，共計(jì)114個(gè)。

2.2胰島素抵抗疾病靶點(diǎn)

通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）輸入關(guān)鍵詞“insulin resistance”查找胰島素抵抗發(fā)病基因，分別下載，其中篩選條件設(shè)置為：DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）優(yōu)選胰島素抵抗分?jǐn)?shù)≥0.1;Genecards數(shù)據(jù)庫 （https：//www.genecards.org/）優(yōu)選胰島素抵抗相關(guān)性≥20;OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）整理首基因。最后將三個(gè)數(shù)據(jù)庫中的所有基因刪除重復(fù)項(xiàng)，整理匯總，作為胰島素抵抗的疾病靶基因，共計(jì)563個(gè)。

2.3異槲皮苷與胰島素抵抗共同靶點(diǎn)

通過Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），針對(duì)異槲皮苷有效靶點(diǎn)和胰島素抵抗靶基因取交集，找到異槲皮苷和胰島素抵抗的共有基因靶點(diǎn)，共計(jì)24個(gè)，將所有共同基因名稱整理匯總，如圖2。

2.4 PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析（Protein-Protein Interaction，PPI）結(jié)果

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string- db.org/），在“Multiple proteins”一欄輸入24個(gè)共同靶點(diǎn)基因名稱，選擇人源基因（Homo sapines），得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做圖，同時(shí)設(shè)置最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)條件為 0.900及以上，得到PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析圖，找出連線緊密的核心基因18個(gè)，再將18個(gè)核心蛋白在“Multiple proteins”一欄輸入，繼續(xù)重復(fù)上述步驟，得到最終PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互做分析圖，如圖3，4。

2.5 富集（GO）分析和KEGG分析結(jié)果

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）在“Start Analysis”頁面中首先在“Enter Gene List”一欄中輸入異槲皮苷和胰島素抵抗的核心基因靶點(diǎn)名稱，然后在“select Identifier”一欄中選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”;在“List Type”選擇“Gene List”;物種選擇人源，于是得到異槲皮苷和胰島素抵抗核心靶點(diǎn)的富集（GO）分析結(jié)果，其中生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）的功能注釋依次根據(jù)數(shù)量降序排列，分別取前10項(xiàng)作圖分析，如圖5，6，7;信號(hào)通路（PATHWAY）按P值升序，取前10個(gè)做餅狀圖，并進(jìn)一步分析，如圖8。接著利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html）同樣輸入人源核心基因18個(gè)，首先驗(yàn)證DAVID數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)庫搜索得出的關(guān)鍵靶點(diǎn)數(shù)量較多的信號(hào)通路的疾病名稱是否基本一致，再著重分析與胰島素抵抗相關(guān)的信號(hào)通路，在胰島素抵抗信號(hào)通路圖上，肝臟細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)有TNFα、IKKβ、INSR、PI3K、AKT2、GSK- 3，如圖10。

2.6異槲皮苷單成分-靶點(diǎn)-通路-疾病Cytoscape作圖可視化分析結(jié)果

通過Cytoscape作圖軟件繪制異槲皮苷和胰島素抵抗“單成分藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系驗(yàn)證異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機(jī)制，其中通路篩選GO分析里“KEGG-pathway”中P值≤9.76E-10的信號(hào)通路，如圖11。

3結(jié)論

胰島素抵抗是細(xì)胞對(duì)胰島素的作用產(chǎn)生抵抗的一種狀態(tài)。胰島素抵抗普遍存在于多種代謝性疾病中，包括代謝綜合征（MS）、2型糖尿病、高血壓、血脂紊亂、心腦血管疾病[7]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論驗(yàn)證出異槲皮苷改善胰島素抵抗的信號(hào)通路包括PI3K -Akt、mTOR、胰島素抵抗、糖尿病心肌病等[8]，其中胰島素抵抗信號(hào)通路尤為重要，在胰島素抵抗信號(hào)通路上顯示了多種作用機(jī)制：（a）通過絲氨酸/蘇氨酸激酶（如JNK1和IKKB）和蛋白激酶C增加IRS（胰島素受體底物）蛋白的磷酸化;（b）通過mTOR信號(hào)途徑增加IRS-1蛋白酶體的降解;（c）降低信號(hào)分子的活化包括PI3K和AKT[9-10];（d）磷酸酶（包括PTPs、PTEN和PP2A）活性的增加。另外，胰島素抵抗導(dǎo)致GLUT4易位減少，導(dǎo)致骨骼肌葡萄糖攝取和糖原合成增加，以及肝臟糖異生和糖原合成減少[11]。由胰島素抵抗信號(hào)通路得知異槲皮苷改善胰島素抵抗的主要途徑之一是通過激活肝臟PI3K/AKT信號(hào)通路改善胰島素抵抗，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括INSR、PI3K、AKT2、GSK-3，可促進(jìn)肝糖原的合成以及葡萄糖氧化分解，達(dá)到調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝紊亂的效果。而TNFα、IKKβ關(guān)鍵靶點(diǎn)可控制炎癥因子的分泌[12]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)異槲皮苷改善胰島素抵抗的藥效成分、作用靶點(diǎn)及通路進(jìn)行了分析，預(yù)測(cè)了異槲皮苷改善胰島素抵抗的基因靶點(diǎn)與作用通路，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)表明異槲皮苷可以改善胰島素抵抗[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了異槲皮苷可以通過多靶點(diǎn)、多通路改善胰島素抵抗的特點(diǎn)，初步驗(yàn)證的結(jié)果則表明了網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測(cè)的可行性，為異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機(jī)制深入研究提供依據(jù)。

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作者簡(jiǎn)介：

張傳藝（1996-），女，漢族，重慶，在讀碩士研究生，研究方向：藥學(xué)。

*通訊作者：

黃桂紅（1972-），女，藥學(xué)部主任，主任藥師，教授 ，碩士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗糖尿病藥物研究。