謝東琴，王艷，林鵬*

(1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021；2.廈門(mén)華廈學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

1942年Weissman[1]研究發(fā)現(xiàn)了稀土離子螯合物的特殊發(fā)光性質(zhì)，自此之后對(duì)稀土離子螯合物的研究一度成為科學(xué)界的熱點(diǎn).稀土離子螯合物可作為優(yōu)良的發(fā)光材料，應(yīng)用于激光技術(shù)[2,3]、靜電紡絲[4,5]、光纖放大[6-8]、稀土熒光粉[9]、細(xì)胞成像[10]以及發(fā)光材料[11,12]等的研究.螯合物作為優(yōu)良的發(fā)光材料，其最大的特點(diǎn)是具有較長(zhǎng)的熒光壽命，經(jīng)脈沖激發(fā)光照射后，通過(guò)儀器的時(shí)間分辨功能，延遲一段時(shí)間再測(cè)量螯合物的熒光強(qiáng)度，可有效避免來(lái)自復(fù)雜生物樣品、試劑和材料的短壽命熒光的干擾，進(jìn)而極大地提高測(cè)定方法的靈敏度.

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種非放射免疫標(biāo)記技術(shù)，是以抗原與抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，以發(fā)出長(zhǎng)壽命熒光的稀土離子螯合物為標(biāo)記物，結(jié)合儀器的時(shí)間分辨功能而建立起來(lái)的一種免疫分析技術(shù).該法具有無(wú)放射性污染、標(biāo)記物穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、靈敏、特異、安全、可靠等優(yōu)點(diǎn)[13].作為最靈敏的生物檢測(cè)技術(shù)之一，TRFIA在臨床診斷和生物技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用[14-20]，DELFIA體系是TRFIA法中的經(jīng)典，該體系所用熒光標(biāo)記物本身的熒光強(qiáng)度較弱，免疫反應(yīng)發(fā)生后，需要引入解離增強(qiáng)液使得稀土離子與增強(qiáng)液中的配體形成新的強(qiáng)熒光螯合物，再進(jìn)行熒光的測(cè)定，不僅增加了操作步驟，而且極易受到空氣中稀土離子的污染.合成出熒光強(qiáng)度高、帶有標(biāo)記基團(tuán)的固相稀土離子螯合物，可以彌補(bǔ)DELFIA體系的不足之處.

本文在前人研究基礎(chǔ)之上，首先合成配體4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉(4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline，BCP)，并將該配體同TTA一起與Eu3+進(jìn)行螯合，得到新型固相稀土離子螯合物Eu(TTA)3(4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉)(Eu(TTA)34,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline，EuTBCP).用生物素標(biāo)記兔抗嗜水氣單胞菌抗體，EuTBCP標(biāo)記親和素，然后采用固相TRFIA法檢測(cè)嗜水氣單胞菌B11，將細(xì)菌直接包被在微孔板上，加生物素化抗體，再加SA-BSA-EuTBCP，洗滌后可直接測(cè)量固相熒光.將該法用于檢測(cè)病鰻組織嗜水氣單胞菌，新合成的螯合物可用于水產(chǎn)致病菌的檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Victor X4 多標(biāo)記分析儀(Perkins-Elmer公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Pierce公司)；Direct-Q3超純水一體化系統(tǒng)(Merck millipore公司)；6545 Q-TOF LC/MS(美國(guó)Agilent科技有限公司)；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司).

生物素標(biāo)記試劑盒(24135)(Thermo Scientific Pierce 公司)；2-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)、二甲亞砜(DMSO)(Sigma-Aldrich公司)；4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；25%戊二醛水溶液(美國(guó)Ted Pella公司)；氯磺酸(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；其它相關(guān)試劑均為分析純.

菌株B11分離于患病的日本鰻鱺，并經(jīng)Biolog 自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)(GeneⅢ)鑒定為嗜水氣單胞菌，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No.M2018642.菌株B11接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法確定濃度，并調(diào)整濃度至 1×108cfu/mL備用.用福爾馬林滅活菌株制備菌苗，再用該菌苗注射兔獲得抗血清，抗血清通過(guò)SPA親和層析柱純化得到兔抗IgG，ELISA法測(cè)得其效價(jià)為1∶25600.

1.2 EuTBCP的合成

1.2.1 中間產(chǎn)物BCP的合成

合成路線設(shè)計(jì)：以4,7-二苯基-1,10-菲啰啉為底物，在高溫條件下，和氯磺酸發(fā)生氯磺?；磻?yīng)，主要反應(yīng)方程式如圖1所示：

圖1 4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉合成路線

合成步驟：移取4.0 mL氯磺酸于三口燒瓶中，冰鹽浴冷卻30 min后，稱(chēng)取4,7-二苯基-1,10-菲啰啉(664.8 mg，2 mmol)，固體加料漏斗分4批以1 min間隔將其加入到氯磺酸中，繼續(xù)攪拌30 min.油浴緩慢升溫至85 ℃，反應(yīng)進(jìn)行6 h，薄層色譜(Thin-layer chromatography，TLC)法追蹤反應(yīng)進(jìn)程，待生成的產(chǎn)物不再增加時(shí)停止反應(yīng).反應(yīng)液冷卻至室溫后，逐滴滴加到170 mL冰水中，邊滴加邊攪拌，立即有大量白色沉淀生成，真空抽濾，去離子水快速洗至中性，真空干燥10 h，稱(chēng)重，避光保存在-20 ℃.

1.2.2 EuTBCP的合成

合成路線設(shè)計(jì)：見(jiàn)圖2

合成步驟：稱(chēng)取Eu2O3(88.0 mg，0.025 mmol)溶解在1.0 mL濃鹽酸中，加熱至85 ℃蒸干得水合EuCl3，加入1.5 mL無(wú)水乙醇蒸干得EuCl3，再加入3 mL無(wú)水乙醇溶解EuCl3.稱(chēng)取BCP(264.5 mg，0.5 mmol)溶于10 mL無(wú)水乙醇中，加入EuCl3乙醇溶液，60 ℃攪拌40 min，用NaOH乙醇溶液調(diào)節(jié)pH至6-7之間.稱(chēng)取TTA(331.5 mg，1.5 mmol)溶于5 mL無(wú)水乙醇中，并將其逐滴加入到上述溶液中，60 ℃攪拌回流5 h.冷卻，抽濾，用冷的無(wú)水乙醇快速洗滌沉淀，真空干燥，得淺粉色固體產(chǎn)物，避光保存在-20 ℃[21].

圖2 EuTBCP的合成路線

1.3 生物素化IgG的制備

將抗嗜水氣單胞菌B11血清經(jīng)蛋白A親和層析法純化后，凍干，溶于適量磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒確定IgG原液濃度；取出適量IgG原液用PBS稀釋到1 mL，濃度為2 mg/mL；稱(chēng)取1.1 mg 試劑盒中的生物素溶于200 μL水中，取出27 μL生物素溶液加入到IgG溶液中，4 ℃攪拌2 h；用試劑盒中的蛋白脫鹽柱對(duì)生物素化IgG進(jìn)行純化.

1.4 親和素的EuTBCP標(biāo)記

向0.6 mL的PBS(0.1 mol/L，pH 7.1)加入0.4 mg鏈霉親和素(SA)和0.4 mg牛血清白蛋白(BSA)；加入0.1 mL 2.5%戊二醛，4 ℃磁力攪拌24 h；加入0.4 mg NaBH4室溫孵育2 h；3 L 0.9% NaCl溶液4 ℃透析24 h，其間換透析液1次；加入10 mg NaHCO3，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.1；稱(chēng)取1.5 mg EuTBCP溶在40 μL DMSO中，將其分4次以1 min間隔加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢? h；4 ℃透析24 h，其間換透析液1次；收集標(biāo)記物鏈霉親和素-牛血清白蛋白-EuTBCP(SA-BSA-EuTBCP)，保存在-20 ℃[22].

1.5 免疫反應(yīng)體系的建立

用碳酸鹽包被液將嗜水氣單胞菌B11菌液稀釋成不同濃度，每孔100 μL加入到96孔微孔板中，60 ℃包被12 h；每孔加入300 μL洗滌緩沖液洗板3次，每次3 min；加入200 μL BSA封閉液，37 ℃封閉2 h；洗滌3次，加入1∶200稀釋的生物素化IgG溶液100 μL，37 ℃震育90 min；洗滌3次，加入1∶200稀釋的SA-BSA-EuTBCP溶液100 μL，37 ℃震育90 min；洗滌6次，測(cè)量固相熒光.

2 結(jié)果與討論

2.1 高分辨率質(zhì)譜

圖3為產(chǎn)物EuTBCP(分子式：EuC48H29N2F9Cl2S5O10)的高分辨率質(zhì)譜圖.該物質(zhì)的M++H為1347.88 cm-1，目標(biāo)峰向右的峰依次是在前一個(gè)峰的基礎(chǔ)上加一個(gè)氫原子的峰.

圖3 EuTBCP質(zhì)譜圖

圖4 EuTBCP紅外光譜圖

2.2 紅外光譜

2.3 螯合物熒光性能

圖5給出了濃度為1×10-5mol/L EuTBCP在DMSO中的時(shí)間分辨熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，測(cè)定所用儀器為Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，測(cè)定條件為：延遲時(shí)間0.2 ms，激發(fā)狹縫12 nm，發(fā)射狹縫2 nm，積分時(shí)間1 ms，測(cè)量時(shí)間100 ms.

EuTBCP的熒光衰減曲線如圖6所示，測(cè)定所用儀器為Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)352 nm，發(fā)射波長(zhǎng)614 nm，激發(fā)帶寬12 nm，測(cè)量時(shí)間100 ms，積分時(shí)間0.1 ms.圖7為EuTBCP熒光衰減曲線及其擬合曲線，擬合曲線方程為y=314000e-0.003x，R2= 0.9997.螯合物熒光壽命870 μs.

圖5 EuTBCP時(shí)間分辨熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

圖6 EuTBCP熒光衰減曲線

圖7 EuTBCP熒光衰減曲線及其擬合曲線

圖8 新型螯合物TRFIA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 工作曲線及檢測(cè)限

利用1.5建立的新型螯合物TRFIA法檢測(cè)嗜水氣單胞菌B11，結(jié)果見(jiàn)圖8，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lg TRF=0.0838 lg CFU+2.8081，R2=0.9868，線性范圍為1×105-1×108cfu/mL，檢測(cè)限1×105cfu/mL.

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

利用建立的新型螯合物TRFIA法對(duì)菌株B11以及其他10株水產(chǎn)致病菌株進(jìn)行交叉因素的測(cè)定.結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明抗嗜水氣單胞菌抗體與菌株B11有較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)，與其他菌株均無(wú)明顯交叉反應(yīng).表明建立的新型螯合物TRFIA法可以用于嗜水氣單胞菌的免疫檢測(cè).

表1 新型螯合物TRFIA特異性測(cè)定

2.6 日本鰻鱺實(shí)際樣品檢測(cè)

利用新型螯合物TRFIA法對(duì)20份鰻鱺組織(肝、腎、鰓、腸、肌肉)樣品進(jìn)行嗜水氣單胞菌的檢測(cè)，對(duì)照組以無(wú)菌生理鹽水代替組織樣品.結(jié)果見(jiàn)表2，有15份樣品呈陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性檢出率為75%，這說(shuō)明新型螯合物TRFIA法可用于帶病鰻鱺的早期診斷.

表2 新型螯合物TRFIA法檢測(cè)日本鰻鱺組織樣品結(jié)果

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了一種新型氯磺?；泥彿茊苌锱潴w，使用高分辨率質(zhì)譜和紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明確系目標(biāo)產(chǎn)物4,7-二氯磺基苯-1,10-菲啰啉，并將該配體同TTA一起與Eu3+進(jìn)行螯合，得到新型固相稀土離子螯合物EuTBCP，熒光壽命長(zhǎng)達(dá)870 μs，對(duì)螯合物進(jìn)行時(shí)間分辨熒光光譜掃描，得到其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為352 nm和614 nm.

EuTBCP的氯磺?；梢灾苯雍偷鞍踪|(zhì)連接，無(wú)需解離本身就可產(chǎn)生很強(qiáng)的長(zhǎng)壽命熒光，具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值.將EuTBCP應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的免疫檢測(cè)中，利用建立的新型螯合物直接TRFIA法檢測(cè)嗜水氣單胞菌B11，對(duì)20份患病鰻鱺樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明該方法可用于水產(chǎn)致病菌的檢測(cè).