王榮，廖碧云，石鳳，龐曉霞，劉中林，王俊利

(右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣西 百色 533000)

至今，肺癌仍然是一種發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危及人類的健康。非小細(xì)胞肺癌構(gòu)成了肺癌患者中的主要類型，而非小細(xì)胞肺癌患者中大部分是肺腺癌，其成為研究的主要對象。肺腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及諸多基因和復(fù)雜的信號通路，揭示該過程是當(dāng)前基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。由于大多患者診斷時已到晚期，肺腺癌的5年生存低于15%，尋找肺腺癌新標(biāo)志物對肺腺癌防治有重要意義[1-2]。KPNA2蛋白作為一種核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含有N端、C端和重復(fù)的ARM序列，它結(jié)合核蛋白，進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)作用[3]。近年，越來越多報道表明KPNA2在腫瘤中扮演重要角色，和腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后等密切相關(guān)[4]。本研究將運(yùn)用生物信息學(xué)方法和軟件分析Oncomine數(shù)據(jù)庫等的數(shù)據(jù)，闡明KPNA2在肺腺癌中表達(dá)情況和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 從平臺獲取數(shù)據(jù) Oncomine作為全球大型的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫及整合數(shù)據(jù)平臺，為挖掘腫瘤數(shù)據(jù)信息提供了重要資料[5]。進(jìn)入數(shù)據(jù)庫，根據(jù)研究目的在數(shù)據(jù)庫設(shè)置數(shù)據(jù)獲取條件。UALCAN平臺包含大量的癌癥數(shù)據(jù)信息，是基于TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行癌癥數(shù)據(jù)挖掘[6]。我們分析KPNA2在肺腺癌中表達(dá)，研究其和腫瘤分期及不同性別的聯(lián)系，此外，采用Kaplan-Meier Plotter分析KPNA2表達(dá)水平與肺腺癌患者的預(yù)后關(guān)系。人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas，HPA)含有26000種人類蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞分布，也有多種腫瘤組織中免疫組化情況[7]。因此，我們采用數(shù)據(jù)分析KPNA2基因在正常組織和肺腺癌組織中的免疫組化及在A549細(xì)胞中表達(dá)情況。cBioPortal獲取大規(guī)模癌癥的基因組學(xué)的分子譜和臨床預(yù)后相關(guān)性，能夠?qū)⑦@些豐富的數(shù)據(jù)集作為生物學(xué)解釋和臨床應(yīng)用。TIMER數(shù)據(jù)庫是目前使用較多研究基因和腫瘤免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，TIMER提供多種免疫細(xì)胞，比如B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞等的浸潤情況。因此，我們使用上述數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KPNA2多層次的生物信息學(xué)整合分析。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 23.0軟件作t檢驗(yàn)對比正常組織和肺腺癌組織之間KPNA2表達(dá)差異。Kaplan-Meier統(tǒng)計KPNA2表達(dá)與肺腺癌預(yù)后之間的關(guān)系。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KPNA2在不同類型腫瘤中表達(dá) Oncomine分析總共獲得445項(xiàng)KPNA2在腫瘤研究結(jié)果，包括79項(xiàng)有顯著差異結(jié)果，表達(dá)增高74項(xiàng)，低表達(dá)5項(xiàng)。在10項(xiàng)肺腺癌研究結(jié)果中，KPNA2均呈現(xiàn)高表達(dá)。TIMER數(shù)據(jù)庫分析也發(fā)現(xiàn)KPNA2在許多腫瘤包括肺腺癌中高表達(dá)，見圖1。

2.2 KPNA2在肺腺癌中表達(dá) 我們再次在UALCAN平臺分析，發(fā)現(xiàn)KPNA2在肺腺癌中的表達(dá)水平也顯著高于正常組織(P<0.001)，見圖2。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)KPNA2蛋白在多個樣本中呈陽性，見圖3A。肺腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織，見圖3B、圖3C。該蛋白主要定位于胞核和胞漿，見圖3D。在A549細(xì)胞中免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，KPNA2在胞漿和胞核中，見圖4。Oncomine數(shù)據(jù)庫一共有9項(xiàng)研究關(guān)于KPNA2在肺腺癌和正常組織的mRNA表達(dá)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫中的Meta分析作二次分析，和對照組相比，KPNA2在肺腺癌中表達(dá)升高(P<0.001)，見圖5。

2.3 KPNA2基因表達(dá)與臨床特征間關(guān)系 通過UALCAN平臺分析KPNA2表達(dá)在TCGA數(shù)據(jù)庫中患者的臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KPNA2表達(dá)與腫瘤分期有密切關(guān)系。各個分期和正常組織間的表達(dá)均存在顯著差異(P<0.001)，見圖6A。不同性別的肺腺癌中KPNA2基因表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.001)，見圖6B。

2.4 KPNA2與肺腺癌預(yù)后間的關(guān)系 在數(shù)據(jù)庫之中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KPNA2在肺腺癌中表達(dá)增高。我們獲取TCGA數(shù)據(jù)中相關(guān)的臨床信息，繼而確定該基因和肺腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。在Kaplan-Meier Plotter分析后，我們發(fā)現(xiàn)KPNA2基因表達(dá)和肺腺癌預(yù)后存在高度相關(guān)性。KPNA2基因高表達(dá)水平的患者生存時間較短，低表達(dá)患者的預(yù)后較好(P<0.001)，見圖7。

2.5 KPNA2共表達(dá)基因分析 為進(jìn)一步闡釋KPNA2的作用方式，我們采用cBioPotal數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KPNA2基因的共表達(dá)基因分析。在相關(guān)系數(shù)>0.8和P<0.01的條件下，獲得78個與其有顯著相關(guān)性的基因，再采用DAVID進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GO分析的BP模塊包含有絲分裂姐妹染色單體分離、微管運(yùn)動、染色體分離、有絲分裂胞質(zhì)分裂和紡錘體組裝。CC模塊富集到細(xì)胞質(zhì)、核漿、細(xì)胞核、胞膜和中心體。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，它們和細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、P53信號通路和FOXO信號通路。見表1。

表1 KPNA2共表達(dá)基因的GO分析和KEGG分析

2.6 KPNA2和免疫細(xì)胞浸潤關(guān)系 我們利用TIMER數(shù)據(jù)庫對KPNA2與免疫細(xì)胞浸潤關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)性探索。KPNA2的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)(P<0.001)。KPNA2的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)，見圖8。

3 討論

核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由輸入蛋白家族和輸出蛋白家族兩大類組成，有著蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。其中，最具特征是輸入蛋白家族，包括Karyopherin α和Karyopherin β兩個家族。Karyopherin α家族含有7個成員，Karyopherin α1(KPNA2)是其中之一。KPNA2基因定位在染色體17q23-q24，KPNA2編碼有529個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為58 kDa。該基因有3個結(jié)構(gòu)單元組成，N端和importin β結(jié)合，核定位信號結(jié)合點(diǎn)和入核蛋白結(jié)合，C端的功能尚不明確。KPNA2基因參與細(xì)胞的復(fù)雜的信號通路，有著廣泛的生物學(xué)功能。

目前，已經(jīng)有針對KPNA2在部分腫瘤的報道。學(xué)者發(fā)現(xiàn)下調(diào)KPNA2基因可以減弱結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成、遷移形成和裸鼠的成瘤能力，且結(jié)腸癌組織中mRNA水平和蛋白水平均高于正常組織[8]。在膀胱癌5637細(xì)胞株中，siRNA干擾技術(shù)下調(diào)的KPNA2可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。此外，食管鱗癌中檢測發(fā)現(xiàn)，KPNA2在癌組織的表達(dá)高于癌旁食管組織。而且高表達(dá)與腫瘤的分期、病理分級呈正相關(guān)，可作為判斷腫瘤惡性程度和潛在轉(zhuǎn)移能力的標(biāo)志物[10]。在腫瘤代謝方面，有研究指出KPNA2通過雙重作用于c-myc，從而參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的糖酵解代謝重編程過程[11]。李倩等[12]通過分子生物學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KPNA2通過Erk信號通路與其下游因子參與卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和順鉑敏感性等生物學(xué)行為的調(diào)控。李杰等[13]學(xué)者檢測到KPAN2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平增高，與腫瘤分級呈正相關(guān)的關(guān)系，而與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。敲出KPNA2基因，腫瘤細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力減弱。謝明等[14]的研究表明KPNA2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著升高，對結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷有重要價值。分析KPNA2 基因在惡性黑素瘤和正常組織中表達(dá)，結(jié)果顯示mRNA水平在正常皮損組織中低于惡性黑素瘤組織。生存分析揭示mRNA表達(dá)水平高的腫瘤患者預(yù)后比較差[15]。在舌鱗癌細(xì)胞CAL-27中轉(zhuǎn)入siRNA，干擾后的KPNA2降低CAL-27細(xì)胞遷移侵襲能力[16]。轉(zhuǎn)染KPNA2的過表達(dá)質(zhì)粒，隨后利用qPCR和Western blot檢測到基因在骨肉瘤細(xì)胞143B細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平顯著上調(diào)。CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)出KPNA2上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞增殖，過表達(dá)KPNA2加快細(xì)胞周期進(jìn)程[17]。KPNA2在自噬過程中發(fā)揮作用依賴p53，通過調(diào)控p53的易位促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的化療耐藥和轉(zhuǎn)移[18]。這些研究幾乎都指出KPNA2作為促癌基因參與腫瘤的增殖、遷移和侵襲等過程。

EGF和缺氧通過同時抑制IRF1表達(dá)和提高肺腺癌細(xì)胞的E2F1表達(dá)來促進(jìn)KPNA2的表達(dá)[19]。這涉及該基因在細(xì)胞層次的機(jī)制研究。本研究從生物信息學(xué)方向探討了KPNA2在肺腺癌中的表達(dá)及其和臨床病理、預(yù)后的關(guān)系。通過Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫等中的資料分析，發(fā)現(xiàn)KPNA2在肺腺癌中表達(dá)升高，和肺腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。KPNA2涉及P53和FOXO信號通路，還和部分免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)。結(jié)果表明KPNA2可以在肺腺癌中發(fā)揮促癌作用。本研究采用了權(quán)威的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，增加了結(jié)論的可信度。因此，這對后續(xù)開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)有重要的意義，也為防治肺腺癌的確定新靶點(diǎn)提供了依據(jù)。