黃尾全 王丹麗 蔣元德

( 廣東省東莞市厚街醫(yī)院 廣東 東莞 523945)

尖銳濕疣是由HPV 引起一種皮膚科常見(jiàn)性病，目前治療方法有藥物、激光、電灼、光動(dòng)力療法等，但容易復(fù)發(fā)，給病人造成較大的困擾，本研究探討尖銳濕疣的復(fù)發(fā)與皮損部位p16,Akt的表達(dá)差異是否有關(guān)聯(lián)，以及HPV 各亞型p16,Akt 的表達(dá)是否存在差異。

1.病例收集

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：選取2017 年9 月—2019 年12 月80 名符合中國(guó)疾病預(yù)防控制中心制訂的尖銳濕疣的診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，年齡18 ～52 歲，男女性別比例相同，初次發(fā)病首次就診病例。近1 月內(nèi)未接受系統(tǒng)治療，2 周內(nèi)未接受局部治療者。為排除其他疾病的影響，月經(jīng)期、孕婦、哺乳期女性不做為觀察對(duì)象，有生殖器部位細(xì)菌、滴蟲(chóng)、真菌、感染或合并其他疾病、有全身慢性消耗性疾病或者嚴(yán)重肝腎疾病患者不做為觀察對(duì)象。所有病例均簽署知情同意書(shū)。

2.方法

2.1 HPV 基因分型檢測(cè)

2.1.1 檢測(cè)儀器及試劑 香港凱普公司的HPV 基因檢測(cè)試劑盒，美國(guó)ABI-700PCR 檢測(cè)儀。

2.1.2 HPV 分型原理及步驟 活檢取材采集CA 組織標(biāo)本送本院檢驗(yàn)科，由檢驗(yàn)科嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，進(jìn)行定量PCR 檢測(cè)分型，按HPV 分型結(jié)果分為低危型組、高危型組、高低?；旌闲徒M。

2.2 免疫組化測(cè)定組織中p16、Akt 表達(dá)

2.2.1 免疫組化 活檢取材采集CA 患者皮損標(biāo)本，先用福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，取健康成人包皮環(huán)切組織10 例做正常對(duì)照。切片常規(guī)脫蠟水化，3%過(guò)氧化氫甲醇溶液10min 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)液于微波爐中抗原修復(fù) 10min；非免疫動(dòng)物血清37℃孵育10min；加入一抗4℃濕盒中過(guò)夜孵育，生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30min，鏈霉素-過(guò) 氧化物酶（SP）復(fù)合物37℃孵育30min；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。每次實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照參考已知陽(yáng)性片，陰性對(duì)照則采用PBS 替代第一抗體。

2.2.2 免疫組化結(jié)果判定 參照Krajewska 等的評(píng)分方法分別記錄標(biāo)本中表皮基底細(xì)胞層和棘細(xì)胞層的評(píng)分，弱、中、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度按顏色顯示為黃色、棕黃色、棕褐色分別定義，并且計(jì)為1 ～3 分；然后按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比將＜1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、＞76%記為0 ～4 分；最后綜合兩部分得分。

2.3 治療方案

①物理方法：高頻電灼祛除疣體；②肌注γ 干擾素200 萬(wàn)u，隔日一次，共10 次。

2.4 預(yù)后觀察

手術(shù)后3 個(gè)月內(nèi)每2 周門(mén)診復(fù)查，3 個(gè)月后改為每月門(mén)診復(fù)查，隨訪6 個(gè)月，在患者復(fù)診期間如發(fā)現(xiàn)新發(fā)CA 病灶或者醋酸白試驗(yàn)陽(yáng)性均視為臨床復(fù)發(fā)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 p16、Akt 蛋白在各組中的表達(dá)，低危組Akt 表達(dá)陽(yáng)性38 例，p16 陽(yáng)性35 例，高危組Akt 表達(dá)陽(yáng)性10 例，p16 陽(yáng)性9 例，高低?；旌辖MAkt 表達(dá)陽(yáng)性13 例, p16 陽(yáng)性12 例，正常對(duì)照組Akt 表達(dá)陽(yáng)性2 例，p16 陽(yáng)性2 例；p16、Akt 表達(dá)陽(yáng)性在各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01，均高于正常對(duì)照組，見(jiàn)表1。

表1 各組p16、Akt 蛋白陽(yáng)性率比較[n（%）]

3.2 尖銳濕疣復(fù)發(fā)組Akt、p16 的評(píng)分均高于未復(fù)發(fā)組，兩組之間差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01，見(jiàn)表2。

表2 尖銳濕疣復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組Akt、p16 的評(píng)分情況（±s）

例數(shù)Aktp16復(fù)發(fā)組311.95±0.422.11±0.38未復(fù)發(fā)組491.31±0.361.32±0.29 t-3.927.38 P-＜0.01＜0.01

4.討論

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的皮膚性病科常見(jiàn)性病，臨床表現(xiàn)主要為在生殖器及肛周附近的皮膚黏膜出現(xiàn)皮膚贅生物，患病率呈逐年上升的變化趨勢(shì)。有關(guān)研究統(tǒng)計(jì)有半數(shù)以上的患者在初次治療后可能會(huì)有尖銳濕疣的復(fù)發(fā)[1]。尖銳濕疣的具體復(fù)發(fā)原因目前并不明確，其可能與患者HPV潛伏感染、患者亞臨床感染、細(xì)胞過(guò)度增生和機(jī)體的免疫功能發(fā)生異常等因素相關(guān)[2]。

我們臨床上雖然治療CA 方法有很多種，包括手術(shù)、藥物、激光、冷凍、光動(dòng)力療法等，但是尖銳濕疣的復(fù)發(fā)率還是較高，CA 復(fù)發(fā)的具體原因目前尚未完全闡釋清楚，CA 的易復(fù)發(fā)性可能與細(xì)胞過(guò)度增殖、HPV 感染型別、亞臨床感染和機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂等相關(guān)聯(lián)。有文獻(xiàn)顯示，HPV 亞型混合感染的CA 患者復(fù)發(fā)率要高于單一亞型感染的CA 患者。并且發(fā)現(xiàn)高危型+低危型是主要引起復(fù)發(fā)的一種感染模式[3]。因此，HPV 亞型混合感染有可能是引起患者復(fù)發(fā)的重要原因之一[4]。探究其原因，我們認(rèn)為，HPV 亞型混合感染可能更易造成機(jī)體局部免疫紊亂，從而干擾表皮細(xì)胞正常的生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致局部細(xì)胞凋亡不足。

p16 基因又叫MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，有人把它比作細(xì)胞周期中的剎車(chē)裝置，一旦失靈則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[5]。在宮頸癌研究中，p16 蛋白在宮頸癌中表達(dá)量明顯升高，考慮p16 的高表達(dá)與HPV感染有關(guān)。在正常細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中，p16 通過(guò)視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（Rb 蛋白）發(fā)揮作用[6]。而在HPV 感染時(shí)，HPV 病毒基因E7 與PRb 結(jié)合，導(dǎo)致p16 蛋白反饋性增高，但此時(shí)p16 的生理功能卻喪失[7]。本研究發(fā)現(xiàn)p16 在高危型患者陽(yáng)性率為75.0%，高低?；旌闲蜑?0.5%，低危型為78.6%，正常對(duì)照組為20%，各組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)發(fā)組評(píng)分2.11±0.38，未復(fù)發(fā)組評(píng)分1.32±0.29，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣的復(fù)發(fā)可能與p16 蛋白反饋性增高，失去了正常的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期的功能。

Demeter、馮進(jìn)云等[8,9]研究顯示CA 皮損的表皮細(xì)胞發(fā)生比較明顯的細(xì)胞增殖，除基底細(xì)胞層外，發(fā)現(xiàn)棘層甚至顆粒層細(xì)胞均有增殖活性，而表皮細(xì)胞凋亡卻沒(méi)有相應(yīng)的增加。從而容易導(dǎo)致皮損的復(fù)發(fā)。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱為蛋白激酶B（protein kinase，PKB）?；罨腁kt 可以產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)Akt 高危型患者陽(yáng)性率為83.3%，高低危混合型為76.4%，低危型為74.5，正常對(duì)照組為20%，各組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HPV 感染Akt 表達(dá)高于正常人，而Akt 的過(guò)表達(dá)可能可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而且高危型和高低?；旌闲途哂诘臀Ｐ停f(shuō)明這兩組患者可能更易復(fù)發(fā)，在臨床治療中應(yīng)更加重視此類患者的治療，并且我們發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)的尖銳濕疣患者中Akt 評(píng)分1.95±0.42，高于未復(fù)發(fā)組評(píng)分1.31±0.36，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證明了Akt可能參與了CA的臨床復(fù)發(fā)，我們推測(cè)HPV 可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞永生化，從而逃避宿主的清除，從而引起尖銳濕疣的復(fù)發(fā)。

總之，本項(xiàng)目研究各發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣復(fù)發(fā)患者的Akt、p16的表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)者，說(shuō)明尖銳濕疣的復(fù)發(fā)可能與皮損中Akt、p16 蛋白的過(guò)表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，為臨床上尖銳濕疣起病原因、疾病轉(zhuǎn)歸、疾病的防御及治療提供更扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。