方仁 安振宇 黃偉雄 白先進(jìn) 堯金燕 龍興 周雙云 張繼

摘要：【目的】明確番荔枝常見(jiàn)栽培品種的花粉形態(tài)特征及各品種間的親緣關(guān)系，為番荔枝品種的分類鑒定研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷美鋱?chǎng)發(fā)射掃描電鏡技術(shù)，對(duì)8個(gè)番荔枝栽培品種的花粉形狀、花粉大小及花粉外壁紋飾等形態(tài)特征進(jìn)行觀察，并進(jìn)行主成分和聚類分析。【結(jié)果】供試番荔枝品種的花粉外部形態(tài)均呈長(zhǎng)球形，花粉以四合體形式存在，輻射對(duì)稱，極面觀呈近圓形或菱形或四角形，赤面觀呈近橢圓形，無(wú)萌發(fā)溝;各品種的花粉形狀、花粉大小及花粉外壁網(wǎng)孔密度和大小均存在差異，其中，花粉大小為489.46～721.80 ?m2，極軸長(zhǎng)為25.85～31.10 ?m，赤道軸長(zhǎng)為18.93～23.15 ?m;花粉外壁均為網(wǎng)狀飾紋，網(wǎng)孔直徑為0.22～0.33 ?m，網(wǎng)孔密度為1.61～2.60 n/?m2。非洲驕傲、吉夫納和綠鉆品種間的花粉大小、網(wǎng)孔直徑和網(wǎng)孔密度等性狀指標(biāo)差異不明顯，但與其他供試品種間存在顯著差異（P<0.05）。花粉大小、極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)等特征指標(biāo)與花朵的長(zhǎng)度、花徑寬度、鮮重等性狀指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。主成分分析結(jié)果顯示，花粉外壁紋飾、花粉大小和花粉形狀的差異可作為番荔枝品種分類的參考依據(jù)。而聚類分析結(jié)果顯示，非洲驕傲、吉夫納和綠鉆3個(gè)品種的親緣關(guān)系較接近，歸為一類;其余栽培品種歸為另一類?！窘Y(jié)論】花粉形狀、花粉大小和花粉壁紋飾等性狀指標(biāo)的差異可用作番荔枝品種（系）間親緣關(guān)系及分類鑒定的孢子學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 番荔枝;花粉形態(tài);電鏡掃描;親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： S667.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）07-1553-07

Abstract：【Objective】In order to clarify the pollen morphology and relationship among the cultivated Annona squamosa L. varieties， which provided theoretical basis for the classification and identification of the varieties. 【Method】Cold field emission scanning electron microscopy was used to observe pollen traits ， size and exine ornamentation morphology of eight cultivated A. squamosa varieties， and principal component analysis and cluster analysis were conducted. 【Result】The pollen morphology of eight cultivated A. squamosa varieties were in the form of prolate， which was radially symme-tric and existed in tetrahedral form， the polar view was nearly circular or diamond or quadrangle， while the equatorial view was nearly ellipse， without germ furrow. Their pollen surface characteristics， pollen size， mesh density and mesh diameter were different， the pollen grain size were 489.46-721.80 ?m2， the polar axis length were 25.85-31.10 ?m， the equator axis length were 18.93-23.15 ?m， the pollen exine ornamentation were reticular ornamentation， the mesh diameter sizes were 0.22-0.33 ?m， the mesh density were 1.61-2.60 n/?m2. The difference in pollen size， mesh diameter and mesh density among AP， Gefner and Lüzuan were not obvious， but were significantly different from other varieties（P<0.05）. And the pollen grain size， polar axis length and equator axis length had negative correlation with the length， diameter width and fresh weight of flowers. The results of principal component analysis showed that the differences of pollen exine ornamentation， pollen size and pollen shape could be used as reference for the classification of the A. squamosa varie-ties. And through the cluster analysis of pollen quantitative characteristics， it was found that the genetic relationship among the three varieties of AP， Gefner and Lüzuan， their genetic distance were more closely related and fall into one group. Other cultivated varieties belong to another group. 【Conclusion】There are some differences among the pollen grain shape， size and surface ornamentation， which can provide some evidences for the identification of inter-varieties（lines） kinship and classification of A. squamosa cultivars.

Key words： Annona squamosa L.; pollen morphology; scanning electron microscopy; genetic relationship

Foundation item： Key Research and Development Project of Guangxi（Guike AB19245004）;Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204097-7，Guike AA17204026）;Guangxi Innovation Team Project of National Modern Agricultural Industry Technology System（nycytxgxcxtd-17-15）

0 引言

【研究意義】番荔枝（Annona squamosa L.）又稱釋迦，為番荔枝科（Annonaceae）番荔枝屬（Annona）多年生半落葉性小喬木，起源于熱帶美洲及西印度洋群島（高愛(ài)平等，2003），在我國(guó)已有400多年的栽培歷史，主要分布于廣東、廣西、云南、海南、福建和臺(tái)灣等地，但因栽培技術(shù)落后和新品種匱乏，一直以來(lái)未能充分發(fā)揮其優(yōu)稀特色水果的商品性優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，隨著人們對(duì)番荔枝營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值的深入了解，越來(lái)越多種植戶開(kāi)始傾向于種植番荔枝，由此刺激各地區(qū)加大對(duì)品種引進(jìn)與選育的力度，使得栽培品種不斷豐富。番荔枝在國(guó)內(nèi)的研究起步較晚，當(dāng)前栽培品種遺傳背景復(fù)雜，各品種間植株外觀形狀較相似，肉眼上難以鑒別，品種間的親緣關(guān)系尚未完全闡明。通過(guò)花粉形態(tài)鑒別植物的種和品種在果樹(shù)上已得到廣泛應(yīng)用（薛曉敏等，2012），因此，開(kāi)展花粉形態(tài)觀察與分析，對(duì)鑒別番荔枝品種、了解品種間的親緣關(guān)系及促進(jìn)番荔枝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物的花粉形態(tài)特征僅受基因控制，具備較強(qiáng)的保守性與遺傳穩(wěn)定性，可為種間親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的研究提供可靠依據(jù)（陳常頌等，2012）。劉永和徐鳳霞（2012）利用掃描和透射電子顯微鏡觀察了番荔枝科4屬4種植物的花粉形態(tài)與結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同屬或同屬不同種間的花粉形態(tài)特征差異明顯，多樣性非常豐富;李曉娟等（2013）采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)山東丹參、丹參、南丹參的花粉形態(tài)、花粉大小和花粉外壁網(wǎng)狀雕紋特征均具有較顯著區(qū)別，為揭示其親緣關(guān)系及種間分類鑒定提供了依據(jù);張勇梅等（2014）利用掃描電子顯微鏡對(duì)番荔枝科2屬3種植物干花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Asimina和Disepalum兩屬植物花粉表面紋飾、四合體類型等較相似，兩者在系統(tǒng)發(fā)育中的親緣關(guān)系較近;齊秀娟等（2017）利用掃描電鏡對(duì)30個(gè)獼猴桃品系的花粉進(jìn)行形態(tài)觀察，通過(guò)分析萌發(fā)溝長(zhǎng)度和溝脊寬度、極軸長(zhǎng)度、赤道軸長(zhǎng)度、極軸/赤道、花粉大小及外壁紋飾等，進(jìn)一步明確獼猴桃花粉的外觀形態(tài)與種間分類;謝微微等（2018）通過(guò)掃描電鏡分析茶樹(shù)花粉的微形態(tài)，14個(gè)茶樹(shù)品種的花粉形狀和外壁紋飾的細(xì)微結(jié)構(gòu)與萌發(fā)器官均呈種內(nèi)多樣性和異質(zhì)性，可作為品種鑒別的重要依據(jù)。【本研究切入點(diǎn)】番荔枝花粉超微結(jié)構(gòu)在植物系統(tǒng)分類的研究報(bào)道較少，僅鄭穎穎等（2016）對(duì)2個(gè)番荔枝栽培品種的花粉形態(tài)有過(guò)簡(jiǎn)要描述，有關(guān)花粉超微形態(tài)特征描述還不夠深入，所涉及的花粉形態(tài)指標(biāo)和品種也較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，對(duì)8個(gè)我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)番荔枝栽培品種的花粉形態(tài)、花粉大小和花粉外壁飾紋特征等形態(tài)特征進(jìn)行觀察與比較，旨在為鑒定品種的親緣關(guān)系與分類研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的8份番荔枝栽培品種花粉均采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所番荔枝資源保存圃，分別為：非洲驕傲（A. atemoya H cv. AP）、吉夫納（A. atemoya H cv. Gefner）、泰國(guó)大果（A. squamosa L cv. Damu）、綠鉆（A. atemoya H cv. Lüzuan）、軟枝種（A. squamosa L cv. Soft Branch）、臺(tái)東二號(hào)（A. squamosa L cv. TD No.2）、細(xì)鱗種（A. squamosa L cv. Thin Scale）和紫色種（A. squamosa L cv. Purple）。供試品種均為2015年4月定植的嫁接苗，2016年4月首次成花，樹(shù)體水肥管理水平一致。2019年調(diào)查各品種的花期及花朵性狀（表1）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 花粉采集與保存 試驗(yàn)于2019年5月番荔枝供試品種自然花的盛花期進(jìn)行。分別采集樹(shù)冠外圍不同方向中上部雄蕊成熟的正常花朵，掰去花瓣，用軟毛刷輕掃花朵上的雄蕊群后，將蘸在軟毛刷上的花粉輕彈于電鏡固定液中，室溫下?lián)u勻固定2 h，轉(zhuǎn)移至4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 掃描電鏡觀察 將固定好的花粉經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min;之后依次加入30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%酒精進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)梯度濃度浸泡15 min;再置于臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)干燥;將花粉緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺(tái)上噴金30 s左右;然后置于Regulus 8100型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察并拍照。每個(gè)品種觀察10粒花粉，選取具有代表性的視野觀察花粉形態(tài)特征，1000×視野下觀察極面觀、2000×視野下觀察赤道面觀、30000×視野下觀察外壁紋飾;用AutoCAD2004測(cè)量極軸長(zhǎng)（P）、赤道軸長(zhǎng)（E）和網(wǎng)孔直徑;P×E表示花粉大小，參照王開(kāi)發(fā)和王憲曾（1983）的方法測(cè)定;P/E表示花粉形狀，P/E>2.00為超長(zhǎng)球形，1.33

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和STAT-200進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，品種間顯著性差異采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行比較。利用PASW statistics 18.0對(duì)花粉赤道軸長(zhǎng)、極軸長(zhǎng)、網(wǎng)孔直徑和網(wǎng)孔密度等形態(tài)指標(biāo)的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，并開(kāi)展花粉形態(tài)指標(biāo)與花朵性狀的相關(guān)分析;采用因子分析法開(kāi)展主成分分析，采用組間聯(lián)接法和歐氏距離法開(kāi)展聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同番荔枝栽培品種花粉形態(tài)特征比較

冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)8個(gè)番荔枝栽培品種花粉形態(tài)的觀察結(jié)果如圖1與表2所示。在外部特征上，供試番荔枝花粉均以四合體形式存在，輻射對(duì)稱，赤面觀呈近橢圓形，無(wú)萌發(fā)溝;非洲驕傲、吉夫納和綠鉆的極面觀呈近圓形，其余品種呈菱形或四角形;非洲驕傲、吉夫納和綠鉆的花粉表面較細(xì)膩，其余品種花粉表面干癟粗糙。從花粉形狀來(lái)看，8個(gè)番荔枝栽培品種的花粉基本形狀均為長(zhǎng)球形，其中紫色種花粉的P/E為1.51，與泰國(guó)大果（1.44）差異不顯著（P>0.05，下同），但顯著大于其他供試品種（P<0.05，下同）。從花粉大小來(lái)看，非洲驕傲、吉夫納和綠鉆的花粉大小分別為489.46、499.62和503.02 ?m2，顯著小于其他供試品種。從極軸長(zhǎng)來(lái)看，細(xì)鱗種的極軸長(zhǎng)最大，為31.10 ?m，與軟枝種（30.69 ?m）、臺(tái)東二號(hào)（29.84 ?m）、泰國(guó)大果（28.92 ?m）和紫色種（28.70 ?m）無(wú)顯著差異，但顯著大于非洲驕傲（25.85 ?m）、吉夫納（25.86 ?m）和綠鉆（26.41 ?m）。從赤道軸長(zhǎng)來(lái)看，細(xì)鱗種和軟枝種的赤道軸長(zhǎng)分別為23.15和22.90 ?m，與臺(tái)東二號(hào)（21.52 ?m）和泰國(guó)大果（20.04 ?m）無(wú)顯著差異，但顯著大于吉夫納（19.32 ?m）、綠鉆（19.16 ?m）、紫色種（19.02 ?m）和非洲驕傲（18.93 ?m）。由此可見(jiàn)，番荔枝花粉的外部形狀、赤道軸長(zhǎng)和極軸長(zhǎng)等特征在不同品種間存在一定差異，可作為區(qū)分不同品種的輔助依據(jù)。

2. 2 不同番荔枝栽培品種的花粉外壁紋飾觀察

8個(gè)番荔枝栽培品種在冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下的花粉外壁紋飾特征如圖1-3、1-6、1-9、1-12、1-15、1-18、1-21、1-24所示，供試品種花粉外壁均為網(wǎng)脊與孔穴組成的網(wǎng)狀飾紋，網(wǎng)脊面略凸起或凸起明顯，且分布有橫縱交叉的細(xì)小裂紋?；ǚ弁獗谏暇W(wǎng)孔大小及分布密度等物理性狀在不同品種間存在差異（表3）。其中，非洲驕傲的網(wǎng)孔直徑為0.33 ?m，與吉夫納（0.31 ?m）和綠鉆（0.31 ?m）無(wú)顯著差異，但顯著大于臺(tái)東二號(hào)（0.28 ?m）、紫色種（0.28 ?m）、泰國(guó)大果（0.27 ?m）、細(xì)鱗種（0.26 ?m）和軟枝種（0.22 ?m）。細(xì)鱗種和軟枝種的網(wǎng)孔密度分別為2.60和2.46 n/?m2，與臺(tái)東二號(hào)（2.32 n/?m2）和紫色種（2.30 n/?m2）均無(wú)顯著差異，但這4個(gè)品種網(wǎng)孔密度顯著大于綠鉆（1.70 n/?m2）、吉夫納（1.65 n/?m2）和非洲驕傲（1.61 n/?m2）3個(gè)品種。

2. 3 花粉形態(tài)指標(biāo)與花朵性狀的相關(guān)性

從番荔枝栽培品種的性狀指標(biāo)相關(guān)分析結(jié)果（表4）可知，花粉極軸長(zhǎng)與花朵長(zhǎng)度、花朵鮮重呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與花徑寬度呈顯著負(fù)相關(guān);花粉赤道軸長(zhǎng)與花朵長(zhǎng)度、花徑寬度和花朵鮮重均呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著;花粉大小也與花朵長(zhǎng)度、花徑寬度和花朵鮮重呈負(fù)相關(guān)，其中，與花朵長(zhǎng)度和花朵鮮重相關(guān)性顯著。可見(jiàn)，供試番荔枝花朵外觀性狀決定花粉形態(tài)特征指標(biāo)，花朵表觀特征越大，其花粉形狀特征則越小。但該結(jié)論所涉及植物外觀形態(tài)指標(biāo)過(guò)少，是否可作為番荔枝品種間分類鑒定的依據(jù)還有待進(jìn)一步證實(shí)。

2. 4 花粉形態(tài)的主成分分析結(jié)果

通過(guò)主成分分析可探討各分類單位花粉形態(tài)的主要差異，以及盡可能從花粉形態(tài)上獲取品種親緣關(guān)系的相關(guān)信息（鄭雅馨等，2013）。由表5和表6可知，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)96.881%，已包含供試樣品原始性狀的大部分信息。其中，第一主成分的貢獻(xiàn)率為75.852%，特征向量絕對(duì)值較高的是網(wǎng)孔密度、極軸長(zhǎng)、網(wǎng)孔直徑和花粉大小，其反映了外壁紋飾和花粉大小的性狀;第二主成分的貢獻(xiàn)率為21.029%，特征向量絕對(duì)值較大的是P/E，說(shuō)明花粉形狀也是番荔枝品種分類的重要指標(biāo)之一。綜合第一主成分和第二主成分可得出，影響番荔枝花粉分類的性狀指標(biāo)主要有外壁紋飾、花粉大小和花粉形狀。

2. 5 花粉形態(tài)的聚類分析結(jié)果

聚類分析結(jié)果如圖2所示，以歐氏距離10水平來(lái)劃分，8個(gè)番荔枝品種大致可分為兩大類群，第I類群包括非洲驕傲、吉夫納和綠鉆3個(gè)品種，其親緣關(guān)系較接近，長(zhǎng)球形花粉大小為489.46～503.02 ?m2，網(wǎng)孔直徑0.31～0.33 ?m，網(wǎng)孔密度1.61～1.72 n/?m2;第II類群包括軟枝種、細(xì)鱗種、泰國(guó)大果、臺(tái)東二號(hào)和紫色種5個(gè)品種，長(zhǎng)球形花粉大小為546.31～721.80 ?m2，網(wǎng)孔直徑0.26～0.28 ?m，網(wǎng)孔密度2.08～2.60 n/?m2，其中，軟枝種和細(xì)鱗種親緣較近，泰國(guó)大果、臺(tái)東二號(hào)和紫色種的親緣關(guān)系也較近。由此可見(jiàn)，通過(guò)番荔枝花粉形態(tài)的花粉大小、網(wǎng)孔大小和網(wǎng)孔密度等數(shù)量特征聚類分析可大致反映不同品種間的親緣關(guān)系。

3 討論

植物花粉的形態(tài)特征不易受外界條件所影響，具有較強(qiáng)的遺傳保守性，其遺傳信息可為植物的系統(tǒng)分類與品種鑒定提供可靠的理論依據(jù)（楊林先等，2010;陳常頌等，2012）。本研究通過(guò)冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)8個(gè)番荔枝栽培品種的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)供試品種的花粉均以四合體形式存在，輻射對(duì)稱，花粉呈長(zhǎng)球形，無(wú)萌發(fā)溝，說(shuō)明番荔枝各品種間的花粉外觀形狀差異較少。本研究還發(fā)現(xiàn)供試番荔枝品種的花粉大小、極軸長(zhǎng)度、赤道軸長(zhǎng)度、極軸/赤道軸、網(wǎng)孔密度和網(wǎng)孔直徑等方面均存在差異，與鄧穗生等（2012）對(duì)6種番荔枝屬果樹(shù)的雄蕊特征觀察結(jié)果基本一致，均認(rèn)為雄蕊的花粉大小及外壁部分特征因樹(shù)種的不同而有所差異;其中非洲驕傲、吉夫納和綠鉆品種間的花粉大小、網(wǎng)孔直徑和網(wǎng)孔密度等性狀指標(biāo)差異不明顯，但與其他供試品種間存在顯著差異，說(shuō)明3個(gè)品種具有較近的親緣關(guān)系，可分類為區(qū)別于細(xì)鱗種、軟枝種、臺(tái)東二號(hào)、紫色種和泰國(guó)大果的種類。通過(guò)花粉形態(tài)的主成分分析也發(fā)現(xiàn)，依據(jù)花粉外壁紋飾、花粉大小和花粉形狀等性狀指標(biāo)也能對(duì)番荔枝品種開(kāi)展分類，與鄭雅馨等（2013）利用花粉形態(tài)主成分分析地被菊和部分菊屬近緣種的結(jié)果較接近。

植株品種間具有獨(dú)特的花粉形態(tài)，其指標(biāo)數(shù)據(jù)穩(wěn)定，在進(jìn)行品種分類時(shí)具有較高的區(qū)分效率，可初步作為種屬間分類和品種鑒定的參考依據(jù)，其中花粉形態(tài)的數(shù)量特征聚類分析可大致反映不同種及品系間的親緣關(guān)系（鐘敏等，2016;李京璟等，2017;劉偉等，2018）。本研究的聚類分析結(jié)果表明，在歐氏距離10的水平上，8個(gè)番荔枝栽培品種可初步分為兩大類群，第I類群包括非洲驕傲、吉夫納和綠鉆，其品種間親緣關(guān)系較接近，在花粉形態(tài)、花粉大小及花粉外壁特征上均與第II類群存在明顯的差異。雖然本研究初步了解了番荔枝栽培品種間的親緣關(guān)系與分類，但由于聚類分析未能充分包含植株花粉及外觀形狀等定性特征，因此，研究結(jié)果僅可為番荔枝品種間的分類鑒定提供參考。為更詳細(xì)與準(zhǔn)確地判定番荔枝品種間親緣關(guān)系與分類，還有待對(duì)植株花粉的紋飾、網(wǎng)紋排列、網(wǎng)眼形狀和萌發(fā)孔等定性描述特征，以及結(jié)合植株形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

不同番荔枝栽培品種間的花粉形態(tài)特征存在一定差異，尤其是花粉的形狀、花粉大小及花粉外壁紋飾等性狀指標(biāo)的差異，體現(xiàn)了不同番荔枝品種間存在相應(yīng)的遺傳多樣性與遺傳分化，可用作品種（系）間親緣關(guān)系及分類鑒定的孢子學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）