張秀雙 徐銘軍 車向明 曹秀玲 李曉光

宮頸癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，近年來，我國宮頸癌發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，臨床常采用手術(shù)、放化療結(jié)合等方式進(jìn)行治療［1］。丙泊酚可通過EGFR/JAK2/STAT3 途徑增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡，可作為治療宮頸癌的潛在藥物［2］。丙泊酚通過抑制HOTAIR 而抑制宮頸癌細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。鹽酸羥考酮是一種半合成的蒂巴因衍生物，屬于麻醉藥物，可明顯減輕腫瘤患者疼痛感［4］。但鹽酸羥考酮對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未闡明。特定的長鏈非編碼RNA（LncRNA）在宮頸癌中表達(dá)異常，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為［5］。長鏈非編碼RNA LINC01857（LncRNA LINC01857）在乳腺癌中表達(dá)水平升高，并可能發(fā)揮類癌基因作用［6］。但LINC01857 是否可作為鹽酸羥考酮治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)尚未闡明。因此，本研究主要探討鹽酸羥考酮聯(lián)合LINC01857 對宮頸癌細(xì)胞Siha 增殖、遷移及侵襲的影響及其潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡釋鹽酸羥考酮治療宮頸癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸羥考酮購自北京華素制藥股份有限公司；人宮頸癌細(xì)胞Siha 購自上海信裕生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；胎牛血清購自上海傳秋生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自上海北諾生物科技有限公司；si-NC、si-LINC01857 購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA、pcDNA-LINC01857 購自武漢淼靈生物科技有限公司；Trizol 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；cDNA 合成試劑盒與qRT-PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；MTT 試劑購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 基質(zhì)膠購自上海澤邁生物技術(shù)有限公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin 抗體購自美國CST公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組Siha 細(xì)胞接種于96 孔板（5×103個/孔），分別加入含有不同濃度（20、40、60 μg/mL）的鹽酸羥考酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h［7］，分別記作鹽酸羥考酮低劑量組、鹽酸羥考酮中劑量組、鹽酸羥考酮高劑量組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。參照Lipofectamine2000 試劑盒說明書分別將si-NC、si-LINC01857 轉(zhuǎn)染至Siha 細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-LINC01857組。分別將pcDNA、pcDNALINC01857 轉(zhuǎn)染至Siha 細(xì)胞，加入含有60 μg/mL鹽酸羥考酮的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記作鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA 組、鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中LINC01857的表達(dá)水平采用Trizol 法提取Siha 細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度后置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存，按照cDNA 合成試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95℃2 min，95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共36 次 循 環(huán)。應(yīng) 用 羅 氏LightCycler480 熒光定量PCR 儀檢測LINC01857（內(nèi)參GAPDH）相對表達(dá)量。

1.2.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期Siha 細(xì)胞（2.5×105個/mL）接種于96 孔板（100 μL/孔），按照“1.2.1”分組處理后加入MTT 溶液（20 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入DMSO（150 μL/孔），室溫振蕩孵育5 min 后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值（OD 值）。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取各組Siha 細(xì)胞接種于6 孔板（1×103個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)14 d 后棄舊培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS 洗滌后加入甲醇（500 μL/孔），置于-20℃冰箱內(nèi)孵育20 min，棄甲醇，加入1%結(jié)晶紫染色液染色（400 μL/孔，15 min），蒸餾水洗滌后晾干，觀察克隆形成數(shù)。

1.2.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲

各組Siha 細(xì)胞（2.5×105個/mL）接種于上室（200 μL/孔），下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液（600 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后使用PBS 洗滌，分別加入多聚甲醛（20 min）與結(jié)晶紫染液（10 min），觀察遷移細(xì)胞數(shù)。預(yù)冷培養(yǎng)基被用于稀釋Matrigel 基質(zhì)膠后加入上室（40 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)5 h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 檢測E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)

各組Siha 細(xì)胞加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白（500 μL），使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液（1∶1 000，4℃孵育24 h）與二抗稀釋液（1∶5 000，室溫孵育1 h）后應(yīng)用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸羥考酮對Siha 增殖及LINC01857 表達(dá)的影響

4 組LINC01857 的表達(dá)水平、OD 值、克隆形成數(shù)的比較結(jié)果顯示：鹽酸羥考酮低劑量組＞鹽酸羥考酮中劑量組＞鹽酸羥考酮高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 鹽酸羥考酮對Siha 遷移、侵襲的影響

4 組N-cadherin、遷移細(xì)胞數(shù)（個）、侵襲細(xì)胞數(shù)（個）比較結(jié)果：鹽酸羥考酮低劑量組＞鹽酸羥考酮中劑量組＞鹽酸羥考酮高劑量組；E-cadherin 結(jié)果比較：鹽酸羥考酮低劑量組＜鹽酸羥考酮中劑量組＜鹽酸羥考酮高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

表1 鹽酸羥考酮對Siha 細(xì)胞活性、克隆形成及LINC01857 表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of oxycodone hydrochloride on the activity，clone formation and LINC01857 expression of SiHa cells（±s，n=3）

表1 鹽酸羥考酮對Siha 細(xì)胞活性、克隆形成及LINC01857 表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of oxycodone hydrochloride on the activity，clone formation and LINC01857 expression of SiHa cells（±s，n=3）

分組對照組鹽酸羥考酮低劑量組鹽酸羥考酮中劑量組鹽酸羥考酮高劑量組F 值P 值LINC01857 0.98±0.05 0.95±0.04 0.68±0.04 0.35±0.02 168.787 0.000 OD 值1.30±0.07 1.27±0.07 0.92±0.05 0.70±0.04 72.022 0.000克隆形成數(shù)（個）115.00±3.27 111.33±2.87 87.33±2.62 64.00±2.16 221.292 0.000

2.3 干擾LINC01857 對Siha 增殖、遷移、侵襲的影響

與si-NC 組比較，si-LINC01857 組OD 值降低，克隆形成數(shù)減少，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，N-cadherin 蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖2。

表2 鹽酸羥考酮對Siha 遷移侵襲的影響（±s）Table 2 Effect of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

表2 鹽酸羥考酮對Siha 遷移侵襲的影響（±s）Table 2 Effect of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

分組對照組鹽酸羥考酮低劑量組鹽酸羥考酮中劑量組鹽酸羥考酮高劑量組F 值P 值n3333 E-cadherin 0.18±0.01 0.19±0.01 0.37±0.02 0.64±0.04 252.545 0.000 N-cadherin 0.68±0.04 0.66±0.04 0.39±0.03 0.25±0.02 117.778 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個）235.33±4.19 230.67±4.71 194.33±3.86 152.00±3.27 274.717 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)（個）135.33±4.19 131.67±3.77 98.00±2.45 70.67±2.05 266.580 0.000

表3 干擾LINC01857 對Siha 增殖遷移侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of interference with LINC01857 on proliferation，migration and invasion of SiHa（±s）

表3 干擾LINC01857 對Siha 增殖遷移侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of interference with LINC01857 on proliferation，migration and invasion of SiHa（±s）

分組si-NC si-LINC01857 t 值P 值n33 LINC01857 0.99±0.05 0.19±0.02 25.731 0.000 E-cadherin 0.17±0.01 0.73±0.04 23.525 0.000 N-cadherin 0.69±0.04 0.14±0.01 23.105 0.000 OD 值1.32±0.08 0.54±0.03 15.812 0.000克隆形成數(shù)（個）117.00±3.27 54.33±2.05 28.125 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個）236.33±4.03 127.67±2.49 39.729 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)（個）137.33±4.11 61.33±2.87 26.260 0.000

2.4 過表達(dá)LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha增殖的影響

與鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA 組比較，鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 組OD 值升高，克隆形成數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.5 過表達(dá)LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha遷移、侵襲的影響

與鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA 組比較，鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，E-cadherin 蛋白水平降低，N-cadherin蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表5。

3 討論

丙泊酚通過激活A(yù)MPK 及促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。利多卡因通過調(diào)節(jié)LncRNA-MEG3/miR-421/BTG1 途徑抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。麻醉藥物可調(diào)控宮頸癌等腫瘤細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未闡明［10］。因而本研究積極探尋麻醉藥物對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能作用機(jī)制，為提高宮頸癌治療效果及改善患者預(yù)后提供新方向。

表4 過表達(dá)LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 增殖的抑制作用（±s，n=3）Table 4 Overexpression of LINC01857 can reduce the inhibitory effect of oxycodone hydrochloride on the proliferation of SiHa（±s，n=3）

表4 過表達(dá)LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 增殖的抑制作用（±s，n=3）Table 4 Overexpression of LINC01857 can reduce the inhibitory effect of oxycodone hydrochloride on the proliferation of SiHa（±s，n=3）

分組鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 t 值P 值LINC01857 0.34±0.02 0.89±0.05 17.690 0.000 OD 值0.71±0.03 1.13±0.07 9.552 0.000克隆形成數(shù)（個）65.00±2.45 104.67±3.30 16.718 0.000

表5 過表達(dá)LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 遷移、侵襲的抑制作用（±s）Table 5 overexpression of LINC01857 can reduce the inhibition of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

表5 過表達(dá)LINC01857 能減輕鹽酸羥考酮對Siha 遷移、侵襲的抑制作用（±s）Table 5 overexpression of LINC01857 can reduce the inhibition of oxycodone hydrochloride on migration and invasion of SiHa（±s）

分組鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA鹽酸羥考酮高劑量+pcDNA-LINC01857 t 值P 值n33 E-cadherin 0.62±0.04 0.26±0.02 13.943 0.000 N-cadherin 0.25±0.02 0.53±0.04 10.844 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個）151.33±3.86 221.67±4.19 21.385 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)（個）71.00±2.16 118.67±3.86 18.667 0.000

羥考酮是一種阿片類藥物，用于治療癌癥患者的疼痛，關(guān)于羥考酮對癌細(xì)胞的作用知之甚少［11-13］。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的鹽酸羥考酮處理后可降低宮頸癌細(xì)胞活力，減少克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，并可促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)及抑制N-cadherin 的表達(dá)，且呈劑量依賴性。研究表明E-cadherin 與N-cadherin 屬于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的標(biāo)志物，E-cadherin 表達(dá)水平升高可抑制EMT 轉(zhuǎn)化，而N-cadherin 表達(dá)水平升高可促進(jìn)EMT 轉(zhuǎn)化，EMT 轉(zhuǎn)化后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［14］。提示鹽酸羥考酮可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其作用機(jī)制可能與調(diào)控EMT 轉(zhuǎn)化有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，不同劑量的鹽酸羥考酮處理后可明顯降低LINC01857 的表達(dá)水平，且呈劑量依賴性。研究表明LINC01857 在胰腺癌中表達(dá)水平升高，并可能作為診斷胰腺癌的潛在生物標(biāo)志物［15］。LINC01857 通過調(diào)節(jié)miR-1281/TRIM65 軸促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長、遷移和侵襲［16］。LINC01857 通過調(diào)節(jié)miR-200b 促進(jìn)胃癌的發(fā)展［17］。提示鹽酸羥考酮可能通過下調(diào)LINC01857 的表達(dá)從而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果提示干擾LINC01857 表達(dá)可降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，鹽酸羥考酮通過下調(diào)LINC01857的表達(dá)從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，LINC01857 可能作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)，還可為進(jìn)一步揭示鹽酸羥考酮抗宮頸癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。