郭姍，李藝博，劉鑫，高黎，張彥喜

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.口腔頜面外科;b.兒童口腔科，河南 鄭州 450000)

大鼠為切牙不斷生長的嚙齒類動(dòng)物，是研究牙齒發(fā)育和更新的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。以往有關(guān)于大鼠切牙萌出速率和釉質(zhì)形成細(xì)胞移動(dòng)速度的研究[1-2]，但對(duì)于切牙整個(gè)牙體組織更替所需的時(shí)間少見報(bào)道。氟作為人體中重要的微量元素，攝入過量可引起牙釉質(zhì)出現(xiàn)白堊斑，出現(xiàn)著色甚至缺損等改變，即氟斑牙。氟斑牙是臨床常見疾病，這種前牙的著色性改變顯著影響牙齒美觀，目前常用的治療方法為有創(chuàng)性貼面或全冠修復(fù)等[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過游標(biāo)卡尺法測(cè)量正常及氟化物飼養(yǎng)大鼠下頜切牙萌出情況，明確大鼠下頜切牙更替周期及氟化物對(duì)其影響，為進(jìn)一步研究氟斑牙提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備一次性口腔器械盒，眼科剪，組織鑷，持針器，手術(shù)刀片及刀柄，氟化鈉晶體(Sigma公司，美國)，去離子水，高速渦輪牙科手機(jī)(NSK，日本)，游標(biāo)卡尺，電子秤，超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)，單反相機(jī)(Canon，日本)，體視顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)通過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(倫理審查編號(hào)2019-KY-390)。由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供30只6周齡雄性SD大鼠[許可證號(hào)SCXK(豫)2017-0001]，質(zhì)量為(200.00±20.00)g，隨機(jī)分為3組(對(duì)照組、低氟組、高氟組)，每組10只。對(duì)照組以不含氟的去離子水喂養(yǎng)，低氟組以50 mg·L-1的氟化鈉去離子水喂養(yǎng)，高氟組以100 mg·L-1的氟化鈉去離子水喂養(yǎng)。所有大鼠在溫度為20～25 ℃、相對(duì)濕度為50%～70%的通風(fēng)環(huán)境中飼養(yǎng)，每天定時(shí)喂食，每組大鼠均自主飲食，喂養(yǎng)6周。在實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天使用高速牙科手機(jī)在大鼠右側(cè)下頜切牙遠(yuǎn)中齊齦處刻一標(biāo)記A(見圖1A)，以后每周于齊齦位置做標(biāo)記(見圖1B)，分別記為B、C、D、E、F、G，用游標(biāo)卡尺測(cè)量第1周萌出長度m1和第6周萌出長度m6。觀察記錄氟斑牙的發(fā)生情況。于6周末引頸處死所有大鼠，處死前用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)牙齒樣本齊齦處唇舌側(cè)厚度(見圖1C)。游標(biāo)卡尺測(cè)量萌出長度的過程見圖2。取下頜切牙，清洗干凈牙齒表面黏附組織，在蒸餾水中超聲震蕩清洗5 min。

A為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)標(biāo)記部位；B為實(shí)驗(yàn)過程中標(biāo)記部位；C為唇舌側(cè)厚度測(cè)量部位。

圖2 大鼠牙齒萌出長度測(cè)量

1.3 數(shù)據(jù)的收集收集到牙齒樣本共30顆，體視顯微鏡下(10倍)將牙齒樣本平放觀察，確定根尖及牙尖位置并拍攝牙齒全長照片(見圖3)，使用Image J軟件測(cè)量每個(gè)樣本牙齒總長度，測(cè)量3次取平均值，記為n。計(jì)算m1/n、m6/n值。

圖3 大鼠下頜切牙全長測(cè)量

2 結(jié)果

2.1 氟斑牙發(fā)生情況對(duì)照組牙齒：釉質(zhì)表面光滑，呈棕黃色半透明。低氟組牙齒：釉質(zhì)透明度下降，可見規(guī)則的棕白色相間的條紋狀改變。高氟組牙齒：釉質(zhì)失去光澤，表面大部分呈現(xiàn)白堊色改變。

2.2 牙齒長度及測(cè)量值3組大鼠m1、m6、n、m1/n、m6/n、唇舌側(cè)厚度值相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠牙齒萌出長度及各測(cè)量值比較

3 討論

大鼠下頜切牙從胚胎發(fā)育到萌出過程中，發(fā)育周期較為恒定[5-6]，同時(shí)由于大鼠下頜切牙可終生不斷生長，可以模擬人牙的萌出過程[7]，因此成年大鼠也可作為研究牙齒發(fā)育不同時(shí)期的動(dòng)物模型。文獻(xiàn)報(bào)道，影響牙齒生長萌出速率的因素很多，如萌出力量的改變、萌出阻力的改變、支持組織改建特征的變化等[8]。大鼠切牙生長速率的測(cè)量方法也有所不同，常用的有光學(xué)顯微鏡測(cè)量法和圖像分析法等[9]。本研究監(jiān)測(cè)大鼠切牙更替周期時(shí)采用直接測(cè)量的方法，避免了間接從圖像中測(cè)量分析所造成的誤差，且該方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中，通過比較各組下頜切牙的萌出長度及牙齒總長度，發(fā)現(xiàn)切牙1周萌出長度大約為總長度的1/5，即大鼠切牙完成1次完整更替周期的時(shí)間約為5周，這與Angmar-M?nsson等[10]通過實(shí)驗(yàn)推論出的大鼠切牙釉質(zhì)35 d更新一次的觀點(diǎn)基本一致。該結(jié)果對(duì)開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)建模有指導(dǎo)意義，若使用大鼠來研究某種因素對(duì)牙齒所產(chǎn)生的影響時(shí)，其建模時(shí)間至少應(yīng)大于5周，若該影響因素會(huì)降低切牙的生長速率，則建模時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長。

大鼠下頜切牙的唇側(cè)為牙釉質(zhì)覆蓋牙本質(zhì)而舌側(cè)為牙骨質(zhì)覆蓋牙本質(zhì)，唇側(cè)為牙冠類似物，舌側(cè)為牙根類似物，前者有釉質(zhì)形成器官，不斷分泌牙釉質(zhì)，后者有上皮根鞘組織，與牙體支持組織的發(fā)育有關(guān)[11-12]。大鼠下頜切牙的唇側(cè)(冠部)和舌側(cè)(根部)同時(shí)發(fā)育，釉質(zhì)和牙本質(zhì)發(fā)育過程可分為4個(gè)階段：前期成牙本質(zhì)細(xì)胞期、牙本質(zhì)基質(zhì)分泌期、釉質(zhì)基質(zhì)分泌期和釉質(zhì)鈣化期[13-14]。舌側(cè)由于缺少釉質(zhì)形成器官，牙本質(zhì)形成后，來自牙囊的間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入牙齒表面分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而形成牙骨質(zhì)[15-16]。大量研究證實(shí)在牙齒生長發(fā)育過程中攝入過量的氟化物可導(dǎo)致氟斑牙，其對(duì)牙齒的主要影響在牙釉質(zhì)層，本實(shí)驗(yàn)過程中也觀察到大鼠在攝入過量氟化物的情況下，僅牙釉質(zhì)顏色發(fā)生明顯變化，其病變的進(jìn)展過程為切牙由透亮的淡黃色外觀逐步開始改變，首先出現(xiàn)釉質(zhì)透明度下降，之后低氟組出現(xiàn)白色細(xì)紋，而高氟組牙面從白色細(xì)紋改變進(jìn)一步演變?yōu)榘讏咨?，白堊色斑塊區(qū)域逐漸融合直至整個(gè)牙面呈現(xiàn)白堊色。隨著攝入氟質(zhì)量濃度的增加，病變呈逐漸加重的趨勢(shì)。

比較3組大鼠切牙更替的測(cè)量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)報(bào)道，牙齒生長伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)的改建，攝入過量的金屬離子可抑制參與細(xì)胞外基質(zhì)改建的酶，從而影響大鼠切牙生長速率[8]。破壞切牙正常的咬合接觸關(guān)系也可使大鼠切牙的生長速率改變[17]。大鼠切牙的生長由近牙齒末端的上皮和間充質(zhì)干細(xì)胞來推動(dòng)[18]，攝氟狀態(tài)下并未完全破壞干細(xì)胞的再生能力，且氟化物主要對(duì)牙釉質(zhì)產(chǎn)生影響，對(duì)于構(gòu)成牙齒主體部分的牙本質(zhì)來說未產(chǎn)生較嚴(yán)重的毒性作用[19]，氟可能不會(huì)對(duì)切牙生長造成影響。本研究結(jié)果顯示切牙生長速率未發(fā)生改變，即氟化物未影響切牙的更替周期。由于氟化物不會(huì)使切牙生長速率變慢，因此建立氟斑牙大鼠模型需要5周，不必延長建模時(shí)間。測(cè)量比較各組間切牙唇舌側(cè)厚度，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即氟化物不會(huì)影響牙釉質(zhì)和牙骨質(zhì)部分的生成量。從實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束，大鼠切牙始終保持弓形形態(tài)，說明唇舌側(cè)牙釉質(zhì)和牙骨質(zhì)部分的形成速率也未發(fā)生相對(duì)改變。

綜上所述，大鼠下頜切牙更替周期約為5周，氟化物不會(huì)影響其更替周期及牙骨質(zhì)和牙釉質(zhì)形成速率。