撒 琪 任貴生 徐孝東 陳文萃 郭錦洲 趙 亮 劉志紅 黃湘華

系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性(systemic light chain amyloidosis)，簡稱AL型淀粉樣變性，由單克隆的免疫球蛋白輕鏈錯誤折疊成淀粉樣不溶性纖維在組織器官沉積而致病[1-2]。目前，許多AL型淀粉樣變性的治療方案是從多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)借鑒而來，但二者在生物學上有很大不同。在MM中，細胞遺傳學異常對疾病風險分層有深遠影響，可指導治療決策。細胞遺傳學在MM治療中的重要性已經(jīng)明確，并且這些遺傳學標志物現(xiàn)已納入修訂的國際分期系統(tǒng)中。據(jù)報道，AL型淀粉樣變性存在與MM相似的染色體異常，例如t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)，13或13q缺失，17p缺失和非整倍體型[3-6]。

細胞染色體畸變對AL型淀粉樣變性的影響尚不十分明確。本研究利用間期熒光原位雜交技術(iFISH)分析AL型淀粉樣變性漿細胞遺傳學特征，探索其與患者臨床特征、漿細胞免疫表型間的相關性。

對象與方法

研究對象選取2015年5月至2018年10月國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心收治的確診AL型淀粉樣變性患者102例。所有病例均符合《系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性診斷和治療指南(2016年)》[7]診斷標準。

一般資料收集患者性別、年齡、24h尿蛋白定量、血清白蛋白、球蛋白、尿素氮、血清肌酐、尿酸、堿性磷酸酶、白細胞、血紅蛋白、血小板、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、血游離輕鏈差值(dFLC)、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、肌鈣蛋白T(TnT)、血免疫固定電泳等實驗室檢查結果及器官受累情況。

相關定義器官受累診斷標準[7]：(1)腎臟：尿蛋白定量>0.5 g/d，以白蛋白為主。(2)心臟：心臟超聲平均心室壁厚度>12 mm，排除其他心臟疾??；或是在沒有腎功能不全及心房顫動時NT-proBNP>332 ng/L。(3)肝臟：無心力衰竭時肝臟上下徑(肝叩診時鎖骨中線上量的肝上界到肝下界的距離)>15 cm；或堿性磷酸酶大于正常值上限的1.5倍。(4)外周神經(jīng)：臨床出現(xiàn)對稱性雙下肢感覺運動神經(jīng)病變。

細胞遺傳學異常檢測方法

主要試劑 GLP RB1 DNA 探針、GLP P53 DNA探針、GLP D13S319 DNA 探針、GLP Iq21 DNA 探針、GLP IGH DNA 探針、IGH/CCND1探針，購自北京金菩嘉公司。 免疫CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138、κ和λ游離輕鏈熒光抗體，購自Beckman Coulter公司。CD138磁珠、分選柱、分選器購自德國美天旎公司。

iFISH檢測 無菌操作抽取患者骨髓液，裂解紅細胞，磁珠分選富集CD138+細胞；應用RB1、1q21、D13S319、P53、IGH熒光探針對富集的細胞進行檢測，若IGH異常再進行CCND1/IGH融合基因探針檢測；熒光顯微鏡觀察結果(圖1)。

免疫表型檢測 抽取患者骨髓液，裂解紅細胞，CD19、CD38、CD56、CD117、CD138、κ和λ游離輕鏈抗體染色處理。用流式細胞儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter公司)采用CD38/CD138設門策略圈定雙陽性細胞，分析該群細胞各抗原的表達情況。

統(tǒng)計學分析使用《SPSS 25》軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

臨床特征102例AL型淀粉樣變性患者診斷時的中位年齡55歲，男性57例(55.88%)。存在iFISH異常68例(66.67%)，iFISH無異常34例(33.33%)。兩組患者臨床基線特征見表1。

表1 102例系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性患者 iFISH 檢測基線資料

與iFISH無異常的患者相比，存在iFISH異常的患者dFLC更高(P=0.001)，但兩組患者形態(tài)學檢測骨髓漿細胞數(shù)量無差別，而多參數(shù)流式細胞(multiparametric flow cytometry,MFC)檢測iFISH異?；颊吖撬柚袧{細胞比例為0.65%(0.05%～7.07%)，高于iFISH檢測無異?；颊叩?.42%(0.02%～1.59%)(P=0.04)。器官受累與疾病危險分層兩組間無統(tǒng)計學差異。

iFISH檢測異常的分布68例iFISH異?；颊咧?，55例(80.88%)存在IgH異常，其中t(11;14) 35例(占51.47%)。其余染色體異常類型為：1q21擴增22例(32.35%)，RB1缺失19例(27.94%)，D13S319缺失20例(29.41%)，P53缺失4例(5.88%)。

在68例iFISH異?；颊咧?，39例(57.35%)僅檢測出1種染色體異常，11例(16.18%)檢出2種染色體異常，13例(19.12%)檢出3種染色體異常，5例(7.35%)檢出4種染色體異常。其中最多見的是單獨存在t(11;14)，共計25例(36.76%)。存在RB1缺失或D13S319缺失的患者均合并有其他iFISH異常類型(表2)。

表2 間期熒光原位雜交技術(iFISH)異常的分布

存在4種染色體異常的患者血小板計數(shù)低于其他患者(P=0.005)，血清白蛋白低于僅1種染色體異常的患者(P=0.033)，而血清dFLC更高(P=0.026)；乳酸脫氫酶高于存在2種(P=0.020)和3種染色體異常的患者(P=0.027)(表3)。比較不同染色體異常類型患者實驗室檢查結果，發(fā)現(xiàn)存在RB1缺失和D13S319缺失的患者相較其他存在2種染色體異常的患者血清dFLC更高(P=0.022)。

表3 不同數(shù)目染色體異?；颊吲R床特征比較

細胞遺傳學與免疫表型相關性6例患者未行MFC檢測，剩余96例患者中有16例漿細胞CD117分子檢測結果缺失。按照漿細胞表面CD19、CD56、CD117各分子表達與否將患者分成陰性組與陽性組，比較不同組內(nèi)細胞遺傳學差異。結果顯示，CD19陰性組iFISH異常患者比例高于CD19陽性組(73.53%vs50.00%，P=0.026)。除了1q21擴增，其余各種iFISH異?；颊咚急壤荂D19陰性組高于CD19陽性組(表4)。而CD56、CD117兩組內(nèi)未見明顯差異。

表4 CD19、CD56、CD117分組間期熒光原位雜交技術(iFISH)檢測結果

討 論

AL型淀粉樣變性與MM同屬漿細胞起源的疾病，但二者生物學方面有所不同，AL型淀粉樣變性的漿細胞發(fā)育異常通常處于較早階段[8]，并且疾病的進程取決于淀粉樣蛋白的毒性和游離輕鏈的數(shù)量，而不是異?？寺⌒詽{細胞負荷[9]。AL型淀粉樣變性患者iFISH異常發(fā)生率高于MM患者。在腫瘤負荷通常低于MM的情況下，iFSIH異常的高發(fā)生率可能會導致AL型淀粉樣變性治療結局的復雜性。例如存在t(11:14)的患者治療反應較差，總體生存(OS)也更低[10]。通過iFISH檢測我們發(fā)現(xiàn)，68例存在染色體異常的患者中有55例(53.92%)檢測出IgH異常。IgH異常[包括斷裂、缺失和(或)重排]是B淋巴細胞腫瘤的特征之一，在B淋巴細胞白血病、MM、淋巴瘤中均可見。對于AL型淀粉樣變性來說，IgH異常是其最常見的染色體結構改變之一[11]。IgH基因定位于染色體14q32。研究發(fā)現(xiàn)，IgH易位是非隨機的特異性細胞學變化，在MM中隨著病情進展，其發(fā)生頻率逐漸升高[12]。我們對檢測出IgH異常的患者再進行CCND1/IGH融合基因探針檢測，發(fā)現(xiàn)存在t(11;14)的患者有35例，占IgH異常的63.64%。t(11;14)是AL型淀粉樣變性常見的染色體異常，與細胞周期蛋白D1(CCND1)表達增加所導致的游離輕鏈分泌有關[13]。CCND1通過在細胞周期的早期激活細胞周期蛋白依賴性激酶CDK-4或CDK-6，使得細胞向S期轉變，從而導致視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白磷酸化失活。正常漿細胞不表達CCND1，而在MM腫瘤細胞中過表達[14]。在Bryce等[15]的研究中，AL型淀粉樣變性患者中存在t(11;14)的具有較高的肌鈣蛋白水平和更短的OS。此外，t(11;14)常與治療反應相關：Muchtar等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，與無t(11;14)的患者相比，具有t(11;14)患者接受硼替佐米和免疫調節(jié)聯(lián)合治療的緩解率較低；但t(11;14)對接受硼替佐米治療的患者所產(chǎn)生的不良影響僅存在于臨床特征良好(年齡<65歲，受累器官≤2，低dFLC)和疾病風險較低(Mayo分期I期/II期)的患者中。另一項研究對101例接受硼替佐米和地塞米松聯(lián)合治療的AL 型淀粉樣變性患者進行 FISH 檢測發(fā)現(xiàn)，具有t(11;14)的患者反應率較低，無進展時期和總生存期較短[17]。根據(jù)已有的報道，無論是MM還是AL型淀粉樣變性，t(11;14)均與疾病緩解率較低相關，但其是否為獨立的預后影響因素尚未十分明確。t(11;14)在AL型淀粉樣變性中很常見，但目前尚不清楚該異常是否與淀粉樣蛋白的產(chǎn)生有關。

1q21擴增區(qū)域約為10～15Mb，其中包含CKS1B和PSMD4基因，研究發(fā)現(xiàn)，在MM中前者與疾病進展有關，后者與耐藥性高度相關[18]。CKS1B和PSMD4基因的表達水平可隨1q21拷貝數(shù)增加而提高，從而導致腫瘤增殖能力增強。Bochtler等[19]對103例接受馬法蘭和地塞米松治療的AL型淀粉樣變性患者進行iFISH檢測發(fā)現(xiàn)，有23%的患者存在1q21擴增，并且存在1q21擴增的患者OS較短。此外，存在1q21擴增的患者表現(xiàn)出更高的骨髓漿細胞負荷和較高的dFLC值。明確了1q21擴增是一個獨立的不良預后因素。13q14缺失是MM中常見的染色體異常類型，在AL型淀粉樣變性中同樣存在。RB1和D13S319是13q14最常檢測的區(qū)域，RB1探針對應13q14.1-14.2區(qū)域，D13S319對應13q14.3區(qū)域。RB1缺失或D13S319缺失均提示13q14缺失，二者同時存在提示13q14的大片段缺失。RB1是一種抑癌基因，存在于13號染色體的長臂1區(qū)4帶，其突變后容易導致視網(wǎng)膜母細胞瘤，在某些進展期的MM中存在RB1缺失。一項研究對692例AL型淀粉樣變性患者進行iFISH檢測發(fā)現(xiàn)有41%的患者出現(xiàn)一種以上異常，13號染色體缺失的患者有95%合并其他類型染色體異常，存在t(11;14)的患者中有34%至少合并一種其他染色體異常[16]。本研究中13q14缺失的患者均合并有其他類型的iFISH異常：有11例患者合并伴1q21擴增，5例患者合并t(11;14)。有1例患者僅存在13q14缺失一種染色體異常。此前有研究報道13q14染色體缺失與1q21擴增間高度相關[20]。13號染色體的缺失似乎和心臟受累有關，與漿細胞負荷無關，但具體機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，存在13q14大片段缺失(合并RB1缺失和D13S319缺失)的患者相較其他染色體畸變類型的患者dFLC值更高(P=0.022)。血清dFLC值是衡量AL型淀粉樣變性患者預后的指標之一，染色體13q14缺失是否為影響患者預后的獨立危險因素尚待觀察。 P53位于17號染色體短臂1區(qū)3帶，17p13缺失可導致P53基因突變。P53基因作為經(jīng)典的抑癌基因，其突變與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關。

結合患者臨床特征，我們發(fā)現(xiàn)合并有4種染色體異常的患者實驗室檢查血小板計數(shù)更高，與僅存在1種染色體異常的患者相比血清白蛋白較低，而血dFLC較高，提示合并染色體異常類型越多，疾病嚴重程度更高。此外，存在RB1缺失和D13S319缺失的患者相較其他存在2種染色體異常的患者血清dFLC更高。

結合單克隆漿細胞免疫表型，本研究發(fā)現(xiàn)骨髓漿細胞表面CD19陰性或CD56陽性的患者P53缺失的發(fā)生率更高；CD19陰性的漿細胞除1q21擴增外，其余類型的染色畸變發(fā)生率均高于CD19陽性的漿細胞，提示CD19陰性的漿細胞惡性程度更高。目前研究發(fā)現(xiàn)異常漿細胞多表現(xiàn)為CD19陰性，因此，免疫表型與細胞遺傳學異常具有一定的相關性，但二者聯(lián)系的具體機制仍需要進一步的探索。

本研究尚存在一些不足之處：(1)樣本量小，結果可能存在偏倚；(2)存在IgH異常的患者僅進行t(11;14)的檢測，其他易位類型尚未檢測；(3)患者細胞遺傳學異常與臨床治療、生存和預后之間的關系尚待進一步觀察。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AL型淀粉樣變性患者骨髓漿細胞遺傳學異常發(fā)生率高，且與漿細胞負荷和dFLC更高相關。其中最常見的染色體異常為 t(11:14)，其次為1q21擴增、RB1缺失、D13S319缺失。合并2種iFISH異常的患者中，存在RB1缺失和D13S319缺失的患者dFLC更高 。CD19陰性的漿細胞其遺傳學異常發(fā)生率較CD19陽性的漿細胞更高。