曹家楨，王富春，趙晉瑩，劉雁澤,李 鐵,哈麗娟

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

胃潰瘍是常見的慢性胃腸道消化疾病，是由多種內(nèi)源性或外源性因素如外界應激、幽門螺桿菌感染、非甾體類抗炎藥及不良生活習慣等因素造成，導致侵入性因子（胃酸—胃蛋白酶）和防御性因子（黏液—碳酸氫鹽）失衡[1]，造成胃黏膜及肌層受損或壞死，誘發(fā)潰瘍性病變，以胃黏膜損傷形成潰瘍灶或伴有穿孔出血為主要表現(xiàn)[2]。近年來，超微弱發(fā)光（Ultraweak-emission,UPE）技術逐漸在臨床診斷及基礎醫(yī)學研究中得到應用，其中以電荷耦合器件（charge-coupled device，CCD）為主的圖像采集系統(tǒng)通過采集光子計數(shù)形成二維圖像，以獲取生物體的UPE 強度的時間及空間信息，多用于檢測生物體的自發(fā)輻射情況[3]。為了在不損傷動物的情況下觀察胃潰瘍造模情況，運用活體成像監(jiān)測是研究的關鍵手段之一。本研究擬采用UPE 技術，以應激性胃潰瘍小鼠模型為觀察對象，通過CCD 圖像采集系統(tǒng)觀察其自發(fā)光光子強度及圖像情況，判斷胃潰瘍造模成功與否，從而為探索胃潰瘍的相關機制研究奠定方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選用SPF 級雄性DBA/1J 小鼠16 只，體質(zhì)量（15±2）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學針灸推拿研究所動物房，飼養(yǎng)條件：環(huán)境溫度（20±3）℃，濕度（50±2）%，12 h 明暗交替，自由攝食和飲水，適應性喂養(yǎng)1 周。采用完全隨機法進行分組，空白組8 只，模型組8 只。實驗過程嚴格遵循國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理與使用指南。

1.2 主要試劑和儀器 魯米諾單鈉鹽（阿法埃莎化學有限公司），PBS 磷酸鹽緩沖粉劑（北京鼎國昌盛公司），異氟烷（河北一品制藥股份有限公司），恒溫水箱（常州諾基公司），CCD 圖像采集系統(tǒng)（iXon 888，北愛爾蘭Andor公司），小動物呼吸麻醉機（Matrx VIP3000，美國MIDMARK 公司）

1.3 造模方法 造模方法采用冷水束縛應激法[4]，將模型組小鼠禁食不禁水24 h，放入由50 mL 離心管自制的冷束縛裝置中，使小鼠保持站立姿勢。在離心管上部制造通氣孔，以使小鼠在整個冷束縛過程中保持正常呼吸，并在側(cè)壁制造多個孔洞，使冷水流入離心管內(nèi)，保持內(nèi)外水溫一致。將冷束縛裝置固定在釘板上，放置進恒溫水箱中，使水平面保持在胸骨劍突位置，水溫（22±2）℃，4 h 后將小鼠取出。

1.4 CCD 圖像采集系統(tǒng) 整個實驗測試在暗室內(nèi)完成，該暗室內(nèi)無任何光源，墻壁及地面均刷黑色油漆，無任何磷光或合成色，溫度保持在（20±1.0）℃，暗室內(nèi)儀器的布局如圖1 所示。實驗人員在進入暗室前將飾品、金屬物品等發(fā)光物品卸下，用中性香皂（無香味、無酒精）清洗手部。進入暗室后，更換黑色工作服。實驗過程中的照明均采用自制的紅光手電筒，經(jīng)測試這種光對測試結(jié)果無影響。

CCD 圖像采集系統(tǒng)采用背照式CCD 201 相機，像素分辨率為1024×1024，像素大小為13 μm2，暗電流每秒＜1 電子/像素。使用0.95/25 mm 氙氣透鏡，附帶有16 mm 圖像傳感器，最大光圈f=0.95，使其在低光照條件下也能提供良好質(zhì)量的圖像。相機光譜靈敏度范圍約為200～1 000 nm，在575 nm 時達到量子效率峰值（92%）。該系統(tǒng)配備有冷卻頭及水冷式冷卻機，最低可將CCD 相機溫度維持在-120 ℃。

圖1 暗室內(nèi)布局

1.5 觀察指標 CCD 成像觀察：將小鼠及小動物呼吸麻醉機提前放置在暗室內(nèi)，進行2 h 暗適應。以2.5%濃度的異氟烷0.5 L/min 麻醉條件下完成誘導麻醉后，放置在觀察臺上，以1.5%濃度異氟烷0.5 L/min 的麻醉條件維持麻醉，小鼠呈仰臥位。采用Andor Solis 4.3圖像采集軟件運行Single 模式對小鼠胃部在體表投影位置進行拍照，以確保鏡頭在小鼠胃部正上方，兩者之間距離為30 cm。在確定位置之后，以Accumlate 模式對小鼠進行圖像采集15 min。完成后按體質(zhì)量濃度10 μL/g 對每只小鼠腹腔注射相應量的0.01 mg/μL 魯米諾溶液。魯米諾[5]是一種小分子光子供體，可被活性氧（ROS）激活產(chǎn)生更強的光子，是常用的光子增強劑，對生物無危害。2 min 后再以Accumlate 模式進行圖像采集15 min，觀察CCD 成像情況。

光子強度：運用Andor Solis 4.3 軟件選定小鼠左上腹部為測試部位，對其范圍內(nèi)的光子強度進行數(shù)字化提取，導出到Excel 表格中，定量分析2 組小鼠組內(nèi)及組間注射魯米諾前后光子強度差異。

胃黏膜觀察及潰瘍指數(shù)評分：測試完成后將小鼠從暗室取出，頸椎脫臼處死，立即剖腹取胃，沿胃大彎剪開胃壁，用磷酸鹽緩沖液（PBS）在冰上對胃黏膜進行漂洗數(shù)次后，將胃黏膜展開，平鋪于顯微鏡下，以10 倍視野觀察并按Guth 標準計算胃黏膜損傷指數(shù)[6]：斑點糜爛計1 分，糜爛直徑＜1 mm 為2 分，1 mm ＜糜爛直徑＜2 mm 之間計3 分，2 mm ＜糜爛直徑≤4 mm 計4 分，糜爛直徑＞4 mm 計5 分，寬度＞2 mm 時分值×2，最后所得分相加為潰瘍指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的以均值±標準差（）表示。組內(nèi)比較用配對t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組小鼠CCD 圖像觀察 從采集的圖像可觀察到CCD 相機在暗室環(huán)境下均可捕捉到小鼠圖像。通過肉眼觀察，小鼠整體輪廓清晰，且2 組小鼠胃部圖像無顯著差異。在注射魯米諾后，模型組小鼠左上腹部近胃部光子強度明顯增強，并可出現(xiàn)白色圓形光團；空白組小鼠無明顯改變，見圖2。

圖2 各組小鼠UPE 圖像

2.2 2 組小鼠胃部光子強度比較 見表1。

2.3 2 組潰瘍損傷指數(shù)比較 空白組小鼠胃黏膜光滑，無黏膜糜爛、出血等損傷；模型組小鼠胃竇部有條形點或片狀出血糜爛灶，直徑＜2.5 mm；Guth 指數(shù)為（3.13±0.64）分，2 組有顯著差異（P＜0.05），提示造模成功。

表1 2 組小鼠胃部光子強度比較（）

表1 2 組小鼠胃部光子強度比較（）

注：與空白組注射魯米諾前比較，# P ＜0.05；與空白組注射魯米諾后比較，△P ＜0.05；與模型組注射魯米諾前比較，▲P ＜0.05

3 討論

目前，生物光學成像技術已成為生物醫(yī)學研究的重要工具，將新型宏觀光子成像技術與數(shù)字化分析手段結(jié)合，為研究人員提供了多種可視化生物觀察技術的同時，也提供了科學的研究技術。UPE 技術作為一種非侵入性監(jiān)測手段，能有效的對機體生理、病理情況進行長期觀察。特別是以CCD 為主的圖像采集系統(tǒng)在實驗研究中被廣泛實使用。

本研究通過采集CCD 圖像與光子能量的差異變化驗證胃潰瘍小鼠的造模成功與否，確定UPE 技術為觀察胃潰瘍造模成功的有利手段。通過本方法，不需要將小鼠解剖觀察胃黏膜損傷指數(shù)，可以在活體狀態(tài)下觀察胃潰瘍造模的成功情況，確立胃潰瘍模型，節(jié)約實驗成本、人力及物力資源，為實驗的后續(xù)研究奠定了方法學基礎。本次實驗通過對束縛冷應激之一造模方法進行胃潰瘍的造模及光子強度的判斷，既對胃潰瘍的機制研究提供了理論依據(jù)，且為后續(xù)針刺治療胃潰瘍的機制研究奠定了基礎。