邢立曉，俞 燕，于蒙蒙，常方方，包媛玲，王素艷，高 立，祁小樂，王笑梅，高玉龍*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽免疫抑制病研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚州 225125）

囊膜病毒必須將病毒囊膜與宿主細胞膜融合才能啟動感染[1]。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中，這種膜融合是通過病毒囊膜糖蛋白（Envelope glycoprotein，Env）與宿主細胞受體相互作用而完成的[2]。Env 是由病毒囊膜表面亞單位（Surface subunit，SU：gp85）和跨膜亞單位（Transmembrane subunit，TM：gp37）二聚體組成的異源三聚體[3]。Env 通過SU 與細胞受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附。SU 對細胞受體的識別并結(jié)合決定了該病毒的宿主特異性[4]。與受體結(jié)合且經(jīng)低pH 處理后，TM 發(fā)生構(gòu)象改變，暴露出融合肽，將細胞膜與病毒囊膜拉近，完成膜融合[5]。無論是病毒的初始感染還是隨后的病毒傳播均取決于有效的結(jié)合細胞受體進入易感宿主的能力，因此鑒定細胞受體對于闡明病毒感染侵入機制至關(guān)重要。

作為囊膜病毒的成員之一，禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）α 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬（Alpharetrovirus）。根據(jù)其宿主范圍、受體結(jié)合和干擾模式的不同，ALV 分為A～K 11個亞群[6]。其中A、B、C、D、J、K 為外源性病毒，E 為內(nèi)源性病毒。A、B、J、K 亞群ALV 為常見感染家禽的外源性病毒。A 和B 亞群ALV 感染家禽通常引起淋巴細胞瘤[7]，而J 亞群ALV（ALV-J）感染常引起髓細胞瘤[8]。ALV-K 是2012年首次從中國本地雞——蘆花雞中分離得到的一個ALV 新亞群[9]。該病毒可能在我國本地雞群中已長期存在，作為一種可垂直傳播且易變異的逆轉(zhuǎn)錄病毒，給我國本地雞群禽白血病的防控與凈化帶來挑戰(zhàn)，也嚴重威脅我國本地雞的種源安全和家禽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。不同ALV 亞群病毒通常利用宿主細胞的不同受體介導(dǎo)其感染。研究表明，雞體內(nèi)的低密度脂蛋白相關(guān)蛋白（Tva）由tva 基因編碼，能夠介導(dǎo)ALV-A 的感染[10]。tvb 基因編碼Tvb 蛋白，能夠介導(dǎo)ALV-B、ALV-D 和ALV-E的感染，屬于腫瘤壞死因子受體家族[10-11]。Tvc蛋白由tvc 基因編碼，能夠介導(dǎo)ALV-C 的感染，屬于免疫球蛋白超家族成員[12]。鈉氫離子交換體1（NHE1）蛋白由雞體內(nèi)的管家基因nhe1 編碼[13]，能夠介導(dǎo)ALV-J的感染。ALV-K是新出現(xiàn)的ALV亞群，其侵入細胞和感染機制還不清楚，本研究利用gp85蛋白受體交叉干擾試驗、蛋白互作試驗、受體結(jié)合和受體重建等一系列試驗鑒定了ALV-K的細胞受體，以期為ALV侵入宿主細胞機制及篩選抗ALV 靶點研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞株及質(zhì)粒ALV-K（JS15SG01 株）為本實驗室前期分離并保存。表達綠色熒光蛋白的重組病毒RCAS-K-GFP、RCAS-A-GFP 和RCAS-J-GFP以及HEK293T細胞、DF-1細胞、pCAGGS載體均為本實驗室保存。pCAGGS-s-ALV-A-gp85-Fc、pCAGGSs-ALV-J-gp85-Fc 病毒蛋白真核表達質(zhì)粒以及跨膜表達Tva 蛋白的pCAGGS-tva-Flag 質(zhì)粒、可溶性表達Tva 蛋白的pCAGGS-tva-HA-His 質(zhì)粒均為本實驗室前期構(gòu)建并保存[14]。

1.2 主要試劑鼠抗His 標簽單克隆抗體（MAb）購自北京博奧龍生物公司；FITC 標記山羊抗人Fc IgG、鼠抗HA 標簽MAb、鼠抗Flag 標簽MAb、TRITC 標記山羊抗鼠IgG、FITC 標記兔抗鼠IgG、抗HA 瓊脂磁珠均購自Sigma 公司；Steady-Glo Luciferase Assay System購自Promega 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN 公司；Alexa Fluor 488 標記的驢抗小鼠IgG、蛋白Marker均購自Thermo scientific 公司；IRDye800CW 標記的山羊抗小鼠IgG購自LI-COR Bioscience公司；IRDye800CW直接標記山羊抗人Fc IgG 購自Sigma 公司；NP40 細胞裂解液、DAPI 染色液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HiTrapTMProtein A HP-5 mL 預(yù)裝柱、NiSepharose High Performance 預(yù)裝柱、HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade 均 購 自GE 公 司；Polyjet 轉(zhuǎn) 染 試 劑購自SignaGen Laboratories 公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司。

1.3 ALV-K gp85 蛋白真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)實驗室分離的ALV-K JS15SG01 株gp85 基因序列合成其DNA片段。通過融合PCR在該序列5'端融合信號肽基因片段，同時在其3'端融合人IgG 恒定區(qū)基因片段（Fc），從而獲得融合信號肽和Fc基因序列的可溶性gp85基因片段。將上述基因克隆到pCAGGS載體中構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCAGGS-s-ALV-K-gp85-Fc。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR 鑒定并經(jīng)測序鑒定。

1.4 Tva 蛋白可溶性及跨膜表達的檢測利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書轉(zhuǎn)染10 μg重組質(zhì)粒pCAGGS-tva-HA-His 至鋪有HEK293T 細胞的平皿中，同時以轉(zhuǎn)染pCAGGS 空載體的細胞作為陰性對照，轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞上清，常規(guī)處理后經(jīng)12.5% SDS-PAGE 凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以鼠抗HA MAb（1∶3 000）為一抗，以IRDye800CW 標記的山羊抗鼠IgG（1∶20 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測可溶性Tva（sTva）蛋白的表達。

利用上述轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染2 μg 重組質(zhì)粒pCAGGStva-Flag 至鋪有HEK293T 細胞的激光共聚焦小皿中。轉(zhuǎn)染后24 h，經(jīng)4%多聚甲醛固定及5% BSA 封閉后，以鼠抗Flag MAb（1∶200）為一抗，以Alexa Fluor 488 標記的驢抗小鼠IgG（1∶200）為二抗，DAPI結(jié)合細胞核后，經(jīng)Leica SP2 共聚焦系統(tǒng)檢測Tva 在細胞表面的表達情況。

1.5 不同亞群ALV gp85-Fc蛋白的真核表達及gp85-Fc 和sTva 蛋白純化效果的檢測將pCAGGS-s-ALVA-gp85-Fc、pCAGGS-s-ALV-K-gp85-Fc、pCAGGS-s-ALV-J-gp85-Fc 重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至密度為80%的HEK293T 細胞中，以轉(zhuǎn)染pCAGGS 空載體的HEK293T 細胞做為陰性對照。48 h 后收集上清，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以IRDye800CW標記的山羊抗人Fc IgG（1∶20 000）經(jīng)western blot 檢測ALV-A、ALV-K 和ALV-J gp85-Fc 蛋白的表達。確定上述ALV gp85-Fc 蛋白及1.4 中sTva 蛋白表達后按照制備型液相層析系統(tǒng)（AKTA Explore）操作說明分別對表達有ALV-A、ALV-K、ALV-J gp85-Fc 和sTva 的細胞上清進 行Protein A 和Ni 親和層析純化，制備純化的gp85-Fc 和sTva 蛋白并經(jīng)SDS-PAGE 檢測純化效果。

1.6 ALV-A 和ALV-K 的受體交叉干擾試驗ALVK gp85 蛋白氨基酸序列與ALV-A gp85 蛋白氨基酸序列同源性最高，在80.8%以上。為了檢測二者是否共用細胞受體，本研究進行了ALV-K 和ALV-A重組病毒的受體交叉干擾試驗。將500 μL 純化后的ALV-K gp85、ALV-A gp85 蛋白和本實驗室前期表達的Fc 蛋白[14]分別稀釋為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL 3 種濃度，與DF-1 細胞4 ℃孵育1 h 后，將重組病毒RCAS-A-GFP 以104TCID50/孔的劑量感染不同濃度ALV-K gp85 孵育后的DF-1 細胞；將重組病毒RCAS-K-GFP 以104TCID50/孔的劑量感染不同濃度ALV-A gp85 孵育后的DF-1 細胞。將重組病毒RCAS-K-GFP 以104TCID50/孔的劑x 量感染Fc 孵育后的DF-1 細胞作為陰性對照，以相應(yīng)重組病毒感染的正常DF-1 細胞（不加相應(yīng)的gp85 蛋白）作為陽性對照。感染后24 h 在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光情況。

1.7 ALV-K gp85 與sTva 蛋白相互作用的Pulldown 檢測利用Pull-down 試驗體外驗證ALV-K gp85 與sTva 蛋白的相互作用。將80 μL 抗HA 瓊脂磁珠與20 μg 純化后的sTva 蛋白在4 ℃孵育2 h 后，將磁珠分別與轉(zhuǎn)染了pCAGGS-s-ALV-A-gp85-Fc、pCAGGS-s-ALV-K-gp85-Fc 和pCAGGS-s-ALV-Jgp85-Fc 質(zhì)粒的HEK293T 細胞裂解液一起4 ℃孵育2 h 后，通過SDS-PAGE 分離結(jié)合的蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，以鼠抗HA MAb（1∶3 000）為一抗，以IRDye800CW 標記的山羊抗鼠IgG（1∶20 000）為二抗， 經(jīng)western blot 檢 測sTva 蛋 白 的 表 達。 以IRDye800CW 直接標記的山羊抗人Fc IgG 為抗體經(jīng)western blot 檢測gp85 蛋白是否被sTva 蛋白沉淀，從而確定sTva 和gp85 蛋白之間是否存在互作。將sTva蛋白與pCAGGS-s-ALV-A-gp85-Fc 轉(zhuǎn)染細胞的裂解物孵育后作為陽性對照，將sTva 蛋白與pCAGGSs-ALV-J-gp85-Fc 轉(zhuǎn)染細胞的裂解產(chǎn)物孵育后作為陰性對照。通過近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行Pulldown 結(jié)果分析。

1.8 ALV-K gp85 與sTva 蛋白相互作用的Co-IP 檢測利用IP 試驗驗證ALV-K gp85 與sTva 蛋白在細胞內(nèi)的相互作用。利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，將pCAGGS-s-ALV-A-gp85-Fc、pCAGGS-s-ALV-K-gp85-Fc、pCAGGS-s-ALV-J-gp85-Fc 分別和pCAGGS-tva-HA-His 重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染6 孔板中培養(yǎng)的HEK293T 細胞（每孔2 μg）。轉(zhuǎn)染后48 h，利用NP40 裂解液裂解各組細胞后，分別取40 μL 上清液檢測各蛋白的表達情況。其余的上清液與抗HA 瓊脂磁珠在4 ℃下過夜孵育，利用預(yù)冷的PBS 洗滌后，通過SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，按1.7 中抗體孵育方法及陰陽性對照設(shè)置，經(jīng)western blot 檢測ALV-K gp85 與sTva 在HEK 293T 細胞內(nèi) 的互作。

1.9 ALV-K gp85 蛋白與跨膜表達的Tva 蛋白結(jié)合的檢測將跨膜表達Tva 蛋白的pCAGGS-tva-Flag 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞后24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次后，胰酶消化細胞，3 000 r/min 離心，將細胞沉淀用含5%FBS 的預(yù)冷PBS 洗滌3 次。將約2×106個細胞與500 μL ALV-K gp85 蛋白（200 ng/μL）冰上孵育1 h，以FITC 標記的山羊抗人Fc IgG（1∶200）與細胞作用1 h，以鼠抗Flag MAb（1∶200）為一抗，TRITC 標記的羊抗鼠IgG（1∶200）為二抗。按照上述操作，將跨膜表達的Tva 蛋白與ALV-A gp85 蛋白孵育后作為陽性對照，其與ALV-J gp85 蛋白孵育后作為陰性對照。通過流式細胞術(shù)（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測ALV-K gp85與跨膜表達的Tva 的結(jié)合情況。以ALV-A gp85 蛋白與跨膜表達的Tva 的結(jié)合率作為100%，計算ALV-K gp85 蛋白與跨膜表達的Tva蛋白的相對結(jié)合率。

1.10 Tva 介導(dǎo)RCAS-K-GFP 重組病毒進入非易感細胞中的檢測為進一步驗證Tva 蛋白是ALV-K 的細胞受體，本研究進行了ALV 非易感細胞的受體重建試驗。將HEK293T 細胞按5×105個/孔傳至12 孔板。待細胞長至80%，利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染pCAGGS-tva-Flag 重組質(zhì)粒（每孔1 μg），同時轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag 質(zhì)粒作為空載體對照。轉(zhuǎn)染24 h 后，將重組病毒RCAS-K-GFP 按照104TCID50/的孔的劑量分別感染上述轉(zhuǎn)染各重組質(zhì)粒的HEK293T細胞。以重組病毒RCAS-A-GFP 按照104TCID50/孔的劑量感染轉(zhuǎn)染pCAGGS-tva-Flag 的HEK293T細胞作為陽性對照，以重組病毒RCAS-J-GFP 按照104TCID50/孔的劑量感染轉(zhuǎn)染pCAGGS-tva-Flag 的HEK293T細胞作為陰性對照。在感染后24 h 通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞熒光判斷病毒的進入情況。

2 結(jié) 果

2.1 ALV-K gp85 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將經(jīng)融合PCR 后獲得的基因片段插入pCAGGS 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-s-ALV-K-gp85-Fc。將重組質(zhì)粒用特異性引物進行PCR 擴增，并測序鑒定。結(jié)果表明插入的目的基因序列正確，重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

2.2 不同亞群ALV gp85、Tva 蛋白可溶性及跨膜表達的檢測結(jié)果將ALV-A、ALV-K 和ALV-J gp85重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，48 h 后，收取細胞上清經(jīng)SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞上清均出現(xiàn)了分子量約為100 ku 的目的蛋白，而轉(zhuǎn)染pCAGGS 空載體的陰性對照（NC）則無相應(yīng)條帶（圖1A），這表明ALV-A、ALV-K 和ALV-J gp85 正確表達并分泌至上清。將pCAGGS-tva-HAHis 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，48 h 后，收取細胞上清經(jīng)western blot 鑒定sTva蛋白的表達。結(jié)果顯示得到與預(yù)期分子量（35 ku）大小一致的sTva 蛋白（圖1B）。分別利用Protein A親和層析對各ALV gp85蛋白與sTva蛋白的純化結(jié)果顯示，純化效果較好。將pCAGGS-tva-Flag 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，24 h 后利用抗Flag MAb 和驢抗小鼠IgG 染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，HEK293T 細胞膜上出現(xiàn)綠色熒光（圖1C），表明Tva 蛋白跨膜表達在HEK293T 細胞膜上。

圖1 不同亞群ALV gp85、Tva 蛋白可溶性及Tva 蛋白跨膜表達的檢測結(jié)果Fig.1 Identification of protein expression of different subgroups ALV gp85,soluble and transmembrane Tva

2.3 ALV-A、ALV-K 重組病毒的受體交叉干擾試驗結(jié)果將不同濃度的ALV-K gp85 蛋白和ALV-A gp85 蛋白分別與DF-1 細胞作用以封閉細胞表面病毒受體，再分別對應(yīng)感染RCAS-A-GFP 和RCAS-KGFP 重組病毒，24 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察可見，隨著ALV-K gp85 蛋白濃度的升高，感染重組病毒的DF-1 細胞的綠色熒光逐漸減少，表明ALVK gp85 蛋白顯著抑制了RCAS-A-GFP 重組病毒的感染；同樣隨著ALV-A gp85 蛋白濃度的升高，感染重組病毒的DF-1 細胞綠色熒光逐漸減少，表明ALV-A gp85 蛋白顯著抑制了RCAS-K-GFP 重組病毒的感染；而RCAS-K-GFP 感染不同濃度Fc 蛋白作用后的DF-1 細胞產(chǎn)生的綠色熒光則無明顯差異（圖2）。與DF-1細胞共孵育后的ALV-A gp85蛋白能夠明顯抑制大部分ALV-K 的感染；同理，與DF-1 細胞共孵育后的ALV-K gp85 也可以競爭性抑制大部分ALV-A 的感染。表明ALV-A 和ALV-K 存在受體交叉干擾現(xiàn)象，它們可能共用一個細胞受體進入細胞。

圖2 ALV-A 和ALV-K 重組病毒受體的交叉干擾試驗結(jié)果Fig.2 The result of cross-interference of ALV-A and ALV-Krecombination viruses

2.4 ALV-K gp85 與sTva 相互作用的Pull-down 和Co-IP 檢測結(jié)果為驗證ALV-K gp85 能否與sTva 蛋白互作，將純化的sTva 蛋白分別與轉(zhuǎn)染了ALV-A、ALV-K、ALV-J gp85 表達質(zhì)粒的HEK293T 細胞裂解物共孵育后，利用Pull-down 試驗檢測sTva 蛋白與上述ALV gp85 的相互作用。結(jié)果顯示，sTva 蛋白能夠沉淀轉(zhuǎn)染ALV-K gp85 表達質(zhì)粒的HEK293T 細胞中的gp85 蛋白，sTva 蛋白也能夠?qū)⑥D(zhuǎn)染ALV-A gp85 表達質(zhì)粒的陽性對照中的gp85 蛋白沉淀，但sTva 蛋白不能將轉(zhuǎn)染ALV-J gp85 表達質(zhì)粒的陰性對照中的gp85蛋白沉淀（圖3A）。表明ALV-K gp85 蛋白能夠與細胞中的sTva 蛋白相互作用。

進一步利用IP 試驗驗證ALV-K gp85 與sTva 蛋白在細胞內(nèi)的相互作用。利用ALV-K gp85 沉淀sTva的Co-IP 檢測結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染ALV-K gp85 和sTva表達質(zhì)粒的HEK293T 細胞裂解物中，ALV-K gp85能夠?qū)Tva 沉淀（圖3B），共轉(zhuǎn)染ALV-A gp85 和sTva 表達質(zhì)粒的陽性對照細胞中ALV-A gp85 也能將sTva 蛋白沉淀，但共轉(zhuǎn)染ALV-J gp85 和sTva 表達質(zhì)粒的陰性對照細胞中ALV-J gp85 則不能將sTva 蛋白沉淀。以上結(jié)果充分證明ALV-K gp85 蛋白和HEK293T 細胞中的sTva 蛋白存在相互作用。

圖3 ALV-K gp85 蛋白與sTva 蛋白互作的檢測結(jié)果Fig.3 The result of the interaction between ALV-K gp85 and sTva

2.5 ALV-K gp85 與跨膜表達的Tva 結(jié)合的檢測結(jié)果為進一步證明ALV-K gp85 與Tva 蛋白的結(jié)合能力，本研究將pCAGGS-tva-Flag 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞36 h 后，孵育ALV-K gp85 蛋白，利用FACS 檢測ALV-K gp85 與跨膜表達的Tva 蛋白的結(jié)合情況。經(jīng)計算結(jié)果顯示，ALV-K gp85 蛋白與跨膜表達的Tva 蛋白相對結(jié)合率超過90%，與陽性對照中ALV-A gp85 蛋白與跨膜表達Tva 蛋白的結(jié)合能力相近，而陰性對照中ALV-J gp85 蛋白與跨膜表達Tva 蛋白的結(jié)合率低于15%（圖4）。表明ALV-K gp85 蛋白能特異識別并結(jié)合HEK293T 細胞膜表面的Tva 蛋白。

圖4 ALV-K gp85 蛋白與跨膜表達的Tva 蛋白結(jié)合的檢測結(jié)果Fig.4 The results of ALV-K gp85 binding to transmembrane expressed Tva proteina

2.6 Tva 介導(dǎo)RCAS-K-GFP 重組病毒進入非易感細胞的檢測結(jié)果將pCAGGS-tva-Flag 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，24 h 后，感染重組病毒RCAS-KGFP，通過倒置熒光顯微鏡觀察可見，與陽性對照RCAS-A-GFP 感染表達Tva 蛋白的細胞相似，感染RCAS-K-GFP 的HEK293T 細胞也出現(xiàn)較強綠色熒光（圖5）。而空載體對照組（RCAS-K-GFP 感染空載體pCAGGS-Flag 轉(zhuǎn)染的HEK293T 細胞）和陰性對照組（RCAS-J-GFP 感染表達Tva 蛋白的HEK293T 細胞）均無綠色熒光（圖5），上述結(jié)果表明Tva 蛋白能夠特異性介導(dǎo)ALV-K 進入非易感細胞，進一步證明其是ALV-K 的受體。

圖5 Tva 介導(dǎo)RCAS-K-GFP 重組病毒進入非易感細胞的檢測結(jié)果Fig.5 Tva mediates RCAS-K-GFP recombinant virus into non-susceptible cells

3 討 論

病毒受體是存在于宿主細胞表面的細胞膜成分，在病毒感染過程中起著至關(guān)重要的作用，病毒識別并結(jié)合宿主細胞受體是開啟病毒感染過程的第一步。ALV 囊膜蛋白表面亞單位gp85 蛋白識別并結(jié)合細胞受體，誘導(dǎo)跨膜亞單位gp37 蛋白的構(gòu)象改變，形成六螺旋束，導(dǎo)致病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，啟動病毒的感染[15]。ALV-K 是新分離到的ALV，其gp85 基因與外源性ALV-A gp85 基因的同源性最高，而其pol、3'UTR 等基因與內(nèi)源性ALV-E 有較高的同源性[16]。已有研究表明，ALV-K 的復(fù)制能力明顯低于ALV-A[17]，一方面可能是由于ALV-K 基因組中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的長末端重復(fù)序列（LTR）與ALV-E同源性高，而內(nèi)源性ALV-E 復(fù)制能力低下，其LTR轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力弱，這導(dǎo)致ALV-K 基因組的轉(zhuǎn)錄翻譯效率低；另一方面其復(fù)制能力低是否與其侵入易感宿主靶細胞的能力有關(guān)，還不得而知。為了闡明ALV-K 的侵入機制，本研究中對ALV-K 的細胞受體進行了鑒定。

ALV gp85 基因可劃分為3 個可變區(qū)（Variable region，vr）和2 個宿主決定區(qū)（Host range region，hr），其中hr 是影響病毒與受體結(jié)合的主要區(qū)域[18]。ALVK gp85 蛋白全序列和受體決定區(qū)序列均與ALV-A 的同源性最高，為了確定ALV-K 是否與ALV-A 利用相同的細胞受體，本研究首先開展了ALV-A 和ALV-K 受體的交叉干擾試驗。已有研究表明，當(dāng)兩種病毒共用同一受體時，在其易感細胞表面受體有限的前提下，一種病毒的表面蛋白與細胞受體結(jié)合，會競爭性地抑制另一種病毒吸附在該受體上，即前期結(jié)合的病毒蛋白會對后者產(chǎn)生“占位效應(yīng)”[19]。本研究利用具有生物學(xué)活性的ALV-K gp85蛋白預(yù)先結(jié)合DF-1 細胞上的受體，模擬ALV-K 的感染，再接種RCAS-A-GFP 以模擬ALV-A 的超感染。通過熒光顯微鏡觀察到ALV-K 和ALV-A 對宿主細胞的感染具有強烈的交叉干擾現(xiàn)象，即ALV-K gp85 蛋白與受體的結(jié)合抑制了ALV-A 的感染，造成ALV-A 感染力明顯減弱。這種基于受體產(chǎn)生的交叉干擾現(xiàn)象提示這兩種病毒很可能共用同一種細胞受體。逆轉(zhuǎn)錄病毒由于共用同一受體導(dǎo)致交叉干擾的現(xiàn)象之前也有報道，如長臂猿白血病病毒（GALV）與B 亞群貓白血病病毒（FeLV-B）共用相同細胞受體導(dǎo)致的受體交叉干擾[20]。一種病毒感染靶細胞后干擾另一種病毒的超感染也常被用來確定這兩種病毒是否利用相同的受體[21]。

已有研究表明Tva 為ALV-A 的細胞受體[22]。為了進一步證明Tva 也能介導(dǎo)ALV-K 進入宿主細胞，本研究利用ALV-K gp85 蛋白與sTva 蛋白的Pulldown 和Co-IP 試驗進一步證明二者有直接相互作用。并且受體結(jié)合試驗表明ALV-K gp85 蛋白能夠高效與跨膜表達的Tva 結(jié)合。受體重建試驗結(jié)果表明Tva 能夠介導(dǎo)ALV-K 感染非易感細胞。以上結(jié)果充分證明了ALV-K 的細胞受體也是Tva 蛋白。雖然ALV-A 和ALV-K 共用同一細胞受體，但ALV-K 感染的宿主范圍以及感染后引起的臨床癥狀與ALV-A存在差異，這可能與病毒利用受體中的不同位點介導(dǎo)其結(jié)合有關(guān)。這種現(xiàn)象類似于B、D、E 亞群ALV共用Tvb 受體，但是B 亞群ALV 主要與Tvb N 末端的L36、Q37、L41、Y42 產(chǎn)生相互作用，而E 亞群ALV主要與TvbS1中的Y67、N72、D73 3 個氨基酸組成的決定簇結(jié)合[23]。而哪些氨基酸決定Tva 的受體功能以及其與ALV-K gp85 蛋白的哪些氨基酸結(jié)合尚不清楚，需要進一步研究?？傊?，ALV-K 細胞受體的鑒定，對于理解ALV 的感染機制，ALV 與宿主的相互作用以及抗病毒靶點研究有著極為重要的意義。