吳華華，王錦鑫，谷慶花，孫 奧，司鑫鑫，董井泉

（江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），又稱“嗜肉菌”，是僅次于大腸桿菌的人畜共患致病菌，可寄生于人和動(dòng)物的皮膚、鼻腔、咽喉、腸胃、癰、化膿瘡口中。其生存對(duì)環(huán)境要求不高，既能耐受80 ℃的高溫也能存活于15%的NaCl 溶液中[1-2]。金黃色葡萄球菌污染肉、魚、蛋類等食物和水、牛奶等飲品后，會(huì)引起嚴(yán)重感染，如：肺炎、偽膜性腸炎、心包炎、敗血癥、膿毒癥等，甚至危害生命[3-4]。因此，建立快速、靈敏、特異的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法對(duì)于人畜公共衛(wèi)生和食品安全管理至關(guān)重要。

目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法主要有金標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)培養(yǎng)法、PCR 方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等[5-6]。但均存在耗時(shí)長(zhǎng)，不能為感染者提供及時(shí)診斷等缺點(diǎn)。重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA）是一種能夠在37 ℃～42 ℃恒溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)。它利用重組酶UvsX 打開DNA 分子的雙鏈，并通過(guò)具有鏈置換活性的Bsu 聚合酶來(lái)擴(kuò)增靶標(biāo)DNA，約30 min 內(nèi)就可獲得大量的擴(kuò)增產(chǎn)物[7]。該方法不依賴于昂貴的儀器，僅接近人體溫度就可以進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)單，不需要專業(yè)的技術(shù)人員。因此，特別適用于基層實(shí)驗(yàn)室和資源匱乏地區(qū)的檢測(cè)要求?；诖耍狙芯扛鶕?jù)金黃色葡萄球菌的nuc 基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了一種RPA 檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，為金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)提供可行技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株與檢測(cè)樣品金黃色萄球菌（ATCC 6538）、人葡萄球菌（CICC 23976）、沙門氏菌（ATCC 14028）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、單增李斯特菌（ATCC 19115）、腸致病性大腸埃希氏菌（ATCC 43888）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）均由武漢食品化妝品檢驗(yàn)中心從ATCC 菌種保藏中心購(gòu)買，并用于本研究。26 份純牛奶購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校?5 份豬肉樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 主要試劑TwistAmpTMDNA Amplication Kit 購(gòu)自英國(guó)TwistDx 公司；MonPureTMGel＆PCR Clean Kit 和MonTrackTMDL2000 Plus DNA Ladder 均購(gòu)自江蘇莫納生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc 基因（NZ_CP020020.1）的保守序列，結(jié)合RPA 的引物設(shè)計(jì)要求利用Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物：nuc-F：5'-ATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGA- 3'/nuc- R： 5'- TTCGTAAATGCACTTGCTT CAGGACCAT-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為246 bp。引物由通用生物（安徽）有限公司合成。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)和基因組DNA 提取挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 6538）培養(yǎng)物接種到液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL 菌液涂布平板計(jì)數(shù)后，將菌液稀釋至106cfu/mL，并置100 ℃裂解10 min，獲得金黃色葡萄球菌的基因組DNA（106cfu/mL），-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RPA 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化根據(jù)Twist-Amp?Liquid DNA Amplification Kit 使 用 說(shuō) 明，配 置RPA 反應(yīng)體系：46.5 μL 反應(yīng)混合物，1 μL 1.4 制備的模板和2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂。反應(yīng)混合物包括25 μL 反應(yīng)緩沖液（2×）、5 μL Basic e-mix（10×）、2.5 μL Core mix（20×）、nuc-F/nuc-R 引物（10 μmol/L）各2.4 μL 和9.2 μL 蒸餾水。將2.5 μL 280 mmol/L 乙酸鎂和1 μL 模板加入反應(yīng)管的蓋子中。瞬時(shí)離心后，按照說(shuō)明書推薦的反應(yīng)條件，將反應(yīng)混合物立即在37 ℃下孵育30 min 進(jìn)行nuc 基因的RPA 擴(kuò)增。采用方陣法確定RPA 反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度（26 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃），反應(yīng)時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min）。

1.6 RPA 的特異性試驗(yàn)將金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、腸致病性大腸埃希氏菌、創(chuàng)傷弧菌均在100 ℃裂解10 min，獲得相應(yīng)細(xì)菌的基因組DNA，以其為模板，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件，進(jìn)行RPA 擴(kuò)增反應(yīng)，以評(píng)估該方法的特異性。

1.7 RPA 檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度試驗(yàn)取1 mL 金黃色葡萄球菌菌液涂布平板計(jì)數(shù)后，依次10倍倍比稀釋至107cfu/mL～101cfu/mL，并將菌液于100 ℃裂解10 min 提取其基因組DNA。以不同濃度的基因組DNA 為模板，采用優(yōu)化的反應(yīng)條件，進(jìn)行金黃色葡萄球菌RPA 方法的靈敏度試驗(yàn)。

1.8 RPA 檢測(cè)金黃色葡萄球菌人工污染牛奶樣品的靈敏度試驗(yàn)從超市購(gòu)買1 份純牛奶，經(jīng)國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法（GB4789.10-2016）檢測(cè)無(wú)金黃色葡萄球菌污染。取1 mL 新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液（濃度為2×106cfu/mL）10 倍倍比稀釋，取2×106cfu/mL～2×101cfu/mL 的菌液各1 mL，分別與1 mL 牛奶混勻，每個(gè)稀釋度制備5 個(gè)平行樣品，將污染的牛奶樣品置于100 ℃孵育10 min，取1 μL 作為模板按照本研究建立的RPA 方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。以未污染金黃色葡萄球菌的熱失活牛奶作為陰性對(duì)照。

1.9 牛奶和肉制品的檢測(cè)從超市購(gòu)買5 種不同品牌的純牛奶，每種品牌選取5 個(gè)不同生產(chǎn)批次，共計(jì)25 份牛奶樣品。每份樣品取1 mL 置于100 ℃孵育10 min 后，取1 μL 作為模板按照本研究建立的RPA方法檢測(cè)。同時(shí)利用國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法（GB4789.10-2016）對(duì)未熱失活處理的牛奶樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定；從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買25 份豬肉樣品，每份豬肉樣品取30 mg 研磨成糜狀后，使用基因組DNA 提取試劑盒提取其總DNA，取1 μL 作為模板按照本研究建立的RPA 方法檢測(cè)。同時(shí)利用國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法（GB4789.10-2016）對(duì)豬肉樣品進(jìn)行鑒定[8]。比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌nuc基因RPA 擴(kuò)增結(jié)果利用特異性的nuc 基因RPA 引物，以金黃色葡萄球菌的基因組DNA 為模板，擴(kuò)增金黃色葡萄球菌nuc 基因。結(jié)果顯示，得到一條246 bp 的目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。表明特異性RPA 引物nuc-F/nuc-R 可用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

圖1 金黃色葡萄球菌nuc 基因的RPA 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of Staphylococcus aureus targe gene using RPA

2.2 RPA 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果采用方陣法進(jìn)行最適反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的篩選。結(jié)果顯示：不同的溫度經(jīng)RPA 均可獲得目的產(chǎn)物，且擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量隨著溫度升高先增加后減少，而當(dāng)溫度在37 ℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)量最多，因此，該反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃（圖2）；將RPA 反應(yīng)體系在37 ℃孵育15 min～40 min 均可以獲得目的產(chǎn)物，其中，孵育15 min 時(shí)擴(kuò)增條帶較暗，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)擴(kuò)增條帶逐漸變亮，而擴(kuò)增時(shí)間為35 min 時(shí)擴(kuò)增條帶最亮（圖3），因此RPA 最佳反應(yīng)時(shí)間為35 min。

2.3 RPA 的特異性試驗(yàn)結(jié)果利用已優(yōu)化好的RPA 反應(yīng)條件分別對(duì)金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、腸致病性大腸埃希氏菌、創(chuàng)傷弧菌7 種常見食源性致病菌的DNA 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示僅金黃色葡萄球菌擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物，其它致病菌均無(wú)擴(kuò)增條帶（圖4）。表明本研究建立的金黃色葡萄球菌RPA 檢測(cè)方法特異性較強(qiáng)。

圖2 RPA 反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of amplification temperature

圖3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of amplification time

圖4 RPA 的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity test of RPA among different species

2.4 RPA 檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果依次以1 μL 濃度分別為101cfu/mL～107cfu/mL 的金黃色葡萄球菌基因組DNA 為模板，即每個(gè)RPA 反應(yīng)分別加入10-2cfu、10-1cfu、100cfu、101cfu、102cfu、103cfu、104cfu 的模板，進(jìn)行RPA 方法的靈敏度檢測(cè)。結(jié)果顯示該方法對(duì)金黃色葡萄球菌的最低檢出限為10 cfu（圖5），表明本研究建立的金黃色葡萄球菌RPA 方法敏感性較高。

圖5 RPA 的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of RPA

2.5 RPA 檢測(cè)金黃色葡萄球菌人工污染牛奶樣品的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果將終濃度為106cfu/mL～101cfu/mL的金黃色葡萄球菌人工污染的牛奶樣品經(jīng)熱失活后，取1 μL 作為模板即每個(gè)反應(yīng)中加入污染金黃色葡萄球菌濃度為103cfu～10-2cfu，經(jīng)本研究建立的RPA 方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。結(jié)果顯示：污染103cfu～101cfu金黃色葡萄球菌的牛奶樣品經(jīng)RPA 方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而污染100cfu～10-2cfu 金黃色葡萄球菌的牛奶樣品經(jīng)RPA 方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖6），表明該方法對(duì)人工污染金黃色葡萄球菌牛奶的最低檢出限為10 cfu。

圖6 RPA 檢測(cè)污染金黃色葡萄球菌的牛奶樣品靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test of RPA using milk samplescontaminated with S.aureus

2.6 牛奶和肉制品的檢測(cè)結(jié)果利用本研究建立的

RPA 方法分別對(duì)25 份牛奶樣品和25 份豬肉樣品的DNA 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：牛奶樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，豬肉樣品有24 份陰性和1 份陽(yáng)性。上述結(jié)果和兩種樣品的國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果均一致。表明本研究建立的金黃色葡萄球菌RPA 檢測(cè)方法可以用于乳制品和肉制品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。

3 討 論

快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于食源性致病菌的監(jiān)控尤為重要[9]。為控制金黃色葡萄球菌帶來(lái)的危害和應(yīng)對(duì)該菌引起食物中毒的突發(fā)事件，密切監(jiān)測(cè)和快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法的建立對(duì)人畜安全尤為重要。

目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、PCR 法和LAMP 等[10-11]。李苗云等基于金黃色葡萄球菌nuc 基因建立了該菌的Taq-Man 熒光定量PCR 檢測(cè)方法[12]；榮蓉等基于nuc 基因保守序列同一目的片段設(shè)計(jì)了4 條引物，建立了檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌的LAMP 方法[13]。但這些方法均存在耗時(shí)長(zhǎng)、依賴于昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員、引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺點(diǎn)，不能滿足基層醫(yī)療組織和資源匱乏地區(qū)的檢測(cè)要求。

而RPA 技術(shù)是一種能夠在常溫?cái)U(kuò)增的分子診斷方法。該方法不依賴于昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，只需在37～42 ℃反應(yīng)15 min～40 min 即可獲得大量的擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法簡(jiǎn)單易行，為基層醫(yī)療組織和資源匱乏地區(qū)快速、有效的檢測(cè)病原菌提供了可能。劉立兵等利用熒光重組酶聚合酶方法快速檢測(cè)志賀氏菌[14]；Ren 等建立了檢測(cè)布魯氏菌的RPA 方法[15]；Gao 等建立了快速檢測(cè)單增李斯特菌的RPA 方法[16]。本研究基于金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc 基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)RPA 引物，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了RPA擴(kuò)增，并對(duì)反應(yīng)時(shí)間（5 min～40 min）和反應(yīng)溫度（26 ℃～45 ℃）進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示溫度為37 ℃反應(yīng)35 min 時(shí)擴(kuò)增條帶最亮，與RPA 體系中酶的最佳反應(yīng)溫度（37 ℃～39 ℃）一致。此外，該方法與人金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌、腸致病性埃希氏菌、創(chuàng)傷弧菌均不會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，表明其具有較強(qiáng)的特異性。該方法能夠檢測(cè)到低至10 cfu 的金黃色葡萄球菌，是已報(bào)道的常規(guī)PCR 檢測(cè)方法靈敏度的50 倍[17]。金黃色葡萄球菌在乳制品、肉制品中較為常見[18-19]，因此本研究將金黃色葡萄球菌污染牛奶樣品，通過(guò)高溫裂解制備模板后，利用建立的RPA 方法檢測(cè)，結(jié)果獲得了與檢測(cè)純菌液一致的靈敏度，即均為10 cfu。表明該方法可以在一定程度上耐受粗制模板（煮沸法獲得細(xì)菌基因組），而不會(huì)影響其靈敏度。利用該RPA 方法檢測(cè)購(gòu)買的牛奶和豬肉樣品，結(jié)果與國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法獲得了一致的檢測(cè)結(jié)果。表明本研究建立的金黃色葡萄球菌RPA 檢測(cè)方法準(zhǔn)確性較高，可以用于乳制品和肉制品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。

本研究建立的基于RPA 技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，且具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為基層醫(yī)療組織和資源匱乏地區(qū)檢測(cè)金黃色葡萄球菌提供了新的檢測(cè)手段。