葛東穎，仇 港，趙 楠，趙慧君，郭 壯

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽 441053；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610066）

藠頭（Allium chinenseG.Don）又稱蕎頭和薤等，是百合科的多年生宿根性草本植物，因含有大蒜素等活性成分而具有辛辣感，故常加熱或腌制后食用。腌制后的藠頭具有良好的風味和保健功能[1]，其腌制工藝也相對簡單，將去尾的藠頭、碎辣椒和鹽放于壇中密封發(fā)酵2個月，隨后加入熬制的紅糖、醬油、花椒水和白酒繼續(xù)密封發(fā)酵1個月即可。泡菜可分為泡漬泡菜和鹽漬泡菜兩大類[2]，其中四川和東北地區(qū)的泡菜多以泡漬泡菜為主[3]，而腌制藠頭應(yīng)屬于鹽漬泡菜的范疇。作為厭氧自然發(fā)酵的蔬菜制品，泡菜具有豐富的微生物群系，且以乳酸菌為優(yōu)勢類群[4]。采用純培養(yǎng)技術(shù)，湯水平等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，藠頭發(fā)酵液中含有短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermenti）和植物乳球菌（Lactobacillus plantarum）等7種乳酸菌，其中L.brevis的產(chǎn)酸能力與耐鹽性均較強，可作為腌制藠頭制作的潛在使用菌株。

較之純培養(yǎng)技術(shù)，近年興起的高通量測序技術(shù)日趨完善、測序成本逐漸降低、使用范圍也拓展至病原微生物[7]、腸道微生物[8]和發(fā)酵食品微生物[9]多樣性的解析中，實現(xiàn)了不同樣本間微生物類群的平行比較分析[10]。泡菜中的微生物主要來源于環(huán)境和原料表面，對泡菜風味品質(zhì)的形成具有重要的作用[11]，其群系結(jié)構(gòu)與原料[12]、制作方式[13]和地理環(huán)境[14]等因素均息息相關(guān)。恩施土家族苗族自治州來鳳縣，地處鄂、湘和渝三省市交界處，為湖北省的西大門，是一個以土家族為主的多民族聚居縣，境內(nèi)盛產(chǎn)藠頭、藤茶和鳳頭姜等多種特色農(nóng)產(chǎn)品，且具有加工和食用鹽漬泡菜的習俗。目前，關(guān)于MiSeq高通量測序技術(shù)在鹽漬藠頭微生物多樣性解析中應(yīng)用的報道尚少，有關(guān)土家族等少數(shù)民族聚居地區(qū)鹽漬藠頭細菌類群的研究更是尚未開展。

本研究采用MiSeq高通量檢測技術(shù)對來鳳地區(qū)鹽漬藠頭鹽水中細菌菌群進行解析，同時使用PICRUSt技術(shù)對其基因功能進行預(yù)測，以期為后續(xù)鹽漬藠頭等特色泡菜制品的微生物多樣性研究和產(chǎn)業(yè)化提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鹽漬藠頭鹽水：采自湖北省恩施土家族苗族自治州來鳳縣（E109°00′～109°27′，N29°06′～29°40′）的城南農(nóng)貿(mào)大市場、大河鎮(zhèn)菜市場和鄂湘渝邊貿(mào)大市場，共采集6個樣品，記為JT1～JT6，腌制時間均在3.5個月左右。

1.1.2 試劑

DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒：德國QIAGEN公司；338F/806R雙向引物：武漢天一輝遠生物科技有限公司；5×Fast Pfu Buffer、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mix、rTaq酶（5 U/μL）、DL 2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：寶生物工程大連有限公司；MiSeq測序配套試劑：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti FAST梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；164-5050基礎(chǔ)電泳儀：美國Bio-Rad公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；MiSeq PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務(wù)器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

樣品采集時間為2019年12月下旬，選擇藠頭種植和制作地均為來鳳縣的樣品進行采集。樣品采集時從腌制藠頭的壇中取100 mL鹽水，裝入樣品瓶中低溫運回實驗室。

1.3.2 MiSeq高通量測序

采集的鹽水300 r/min離心10 min，去除藠頭殘渣，上清液8 000 r/min離心10 min，去上清，使用DNeasy mericon Food Kit試劑盒對沉淀菌泥的宏基因組DNA進行提取，并以其為模板，參照尚雪嬌等[15]的方法對16S rRNA V3-V4區(qū)序列進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用MiSeq PE250平臺進行高通量測序。

1.3.3 細菌類群解析

使用實驗室自有腳本去除序列核苷酸標簽（barcode）和引物后[16]，將6個樣品序列合并為1個fna文件，提交至QIIME（v1.7.0）平臺[17]進行序列對齊、兩步UCULST分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）劃分[18]、Chimera Slayer嵌合體檢查[19]和序列比對[20]，其中OTU劃分所采用的序列相似度參數(shù)為100%和97%[21]。將鑒定出的細菌門或?qū)侔凑掌骄鄬繌拇蟮叫∵M行排序，排在前3位的則定義為優(yōu)勢細菌門或?qū)賉16]。

1.3.4 基因功能預(yù)測

使用PICRUSt軟件對1.3.3中fna文件中基因的功能進行預(yù)測[22]，并參照蛋白質(zhì)直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）數(shù)據(jù)庫進行注釋[23]。

1.3.5 圖形繪制及數(shù)據(jù)分析

使用Origin8.5軟件繪制柱形圖；使用Excel2017軟件繪制瀑布圖；使用R軟件的waterfall、UpSetR、corrplot和pheatmap軟件包繪制其他圖，其中相關(guān)性熱圖中的相關(guān)系數(shù)采用Pearson 相關(guān)性分析計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序深度分析

本研究使用MiSeq PE250平臺對6個鹽漬藠頭鹽水中細菌類群進行高通量測序，經(jīng)質(zhì)控后共產(chǎn)生288 495條高質(zhì)量16S rRNA V3-V4區(qū)序列，平均每個樣品測序深度為48 083條。切除barcode和引物后序列的堿基長度分布情況見圖1。

圖1 序列長度的分布Fig.1 Distribution of sequences length

由圖1可知，有273 067條序列長度在443～451 bp之間，占總序列數(shù)的94.65%；有14 211條序列長度在425～433 bp，占總序列數(shù)的4.93%；亦有部分序列長度＜433bp或＞451bp，但其數(shù)量較少，僅占總序列數(shù)的0.42%。由此可知，切除barcode和引物后，本研究99.58%的序列長度在425～451 bp，可基本覆蓋16S rRNA V3-V4區(qū)序列，因而后續(xù)可在分類學(xué)地位“門”和“屬”水平上對樣品細菌多樣性進行分析。

2.2 基于門和屬水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)97%相似性將273 067條序列劃分為13 417個OTU，經(jīng)ChimeraSlayer檢查并無嵌合體存在，經(jīng)比對后將所有序列鑒定為28個門和561個屬。為保證分析結(jié)果的準確性，僅對平均相對含量＞1.0%的門和屬進行展示[24]。鹽漬藠頭鹽水中平均相對含量＞1.0%的細菌門見圖2。

圖2 鹽漬藠頭鹽水中平均相對含量＞1.0%的細菌門Fig.2 Bacterial phyla with average relative content more than 1.0%in saline Allium chinese G.Don brine samples

由圖2可知，鹽漬藠頭鹽水中細菌主要隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），平均相對含量分別為43.94%、33.12%、18.21%和2.85%，其中Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria為優(yōu)勢細菌門。鹽漬藠頭鹽水中平均相對含量＞1.0%的細菌屬見圖3。

圖3 鹽漬藠頭鹽水中平均相對含量＞1.0%的細菌屬Fig.3 Bacterial genera with average relative content more than 1.0%in saline Allium chinese G.Don brine samples

由圖3可知，鹽漬藠頭鹽水中存在5個平均相對含量＞1.0%的細菌屬，分別為隸屬于Firmicutes的乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳球菌屬（Lactococcus），以及隸屬于Proteobacteria的假單胞菌屬（Pseudomonas）和隸屬于Actinobacteria的嗜熱油菌屬（Thermoleophilum），平均相對含量依次為30.28%、6.94%、2.94%、18.21%和16.13%。由此可見，Lactobacillus、Pseudomonas和Thermoleophilum為鹽漬藠頭鹽水中的優(yōu)勢細菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽漬藠頭鹽水中的乳酸菌主要為Lactobacillus和Lactococcus，有研究報道指出韓國泡菜Kimchi中的乳酸菌主要為Lactobacillus、魏斯氏菌屬（Weissella）和明串珠菌屬（Leuconostoc）[25]，而四川地區(qū)泡菜中的乳酸菌主要為Lactobacillus、Pediococcus、Lactococcus和Leuconotoc[26-27]，造成不同泡菜中乳酸菌類群存在差異的原因除與原料種類有關(guān)外，還與地域、制作工藝和添加食鹽量等諸多因素有關(guān)[28]。作為條件治病菌，Pseudomonas中的部分種群可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[29]，但本研究發(fā)現(xiàn)其為鹽漬藠頭鹽水中的優(yōu)勢細菌，李欣蔚等[30]采用高通量測序技術(shù)對東北地區(qū)泡菜細菌類群進行解析亦發(fā)現(xiàn)了與本研究相同的現(xiàn)象，Pseudomonas在樣品中的平均相對含量為39.6%～77.7%。由此可見，開展對鹽漬藠頭鹽水中細菌類群的研究，對后續(xù)產(chǎn)品食用安全品質(zhì)的提升具有積極的意義。

2.3 基于OTU水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

若某一OTU在6個鹽漬藠頭鹽水樣品中均存在，則將其定義為核心OTU[31]，OTU在每個樣品中的分布情況見圖4。

圖4 基于OTU的UpSet分布圖Fig.4 Distribution map of UpSet based on OTU

由圖4可知，樣品JT1～JT6分別含有3 256、2 843、3 272、4 296、2 636和2 980個OTU，其中219個為核心OTU，占OTU總數(shù)的1.63%，但包含了217998條序列，占總序列數(shù)的75.56%，14個核心OTU的平均相對含量＞1.0%，累計平均相對含量為43.14%，其平均相對含量的分布見圖5。

圖5 平均相對含量＞1.0%核心OTU的瀑布圖Fig.5 Waterfall plot of core OTUs with average relative content more than 1.0%

由圖5可知，分別有5、3、3、2和1個OTU被鑒定隸屬于Thermoleophilum、Lactobacillus、Pseudomonas、Bacillus和Lactococcus，累計平均相對含量分別為7.98%、15.58%、11.96%、2.27%和5.35%。平均相對含量＞1.0%核心OTU相關(guān)性的熱圖見圖6。

圖6 平均相對含量＞1.0%核心OTU相關(guān)性的熱圖Fig.6 Heatmap of correlation of core OTUs with average relative content more than 1.0%

由圖6可知，隸屬于Pseudomonas的OTU8969和OTU1016與5個隸屬于Thermoleophilum的核心OTU均呈現(xiàn)非常顯著（P＜0.01）或極顯著（P＜0.001）正相關(guān)，而隸屬于Lactobacillus和Lactococcus的核心OTU與其他屬的核心OTU相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。此外，Thermoleophilum、Lactobacillus、Pseudomonas或Bacillus等同屬內(nèi)的部分核心OTU之間亦存在一定的正相關(guān)，且相關(guān)性非常顯著（P＜0.01）或極顯著（P＜0.001）。由此可見，6個鹽漬藠頭鹽水共有大量的細菌類群，且不同類群間可能有一定的共生關(guān)系。

2.4 基因功能預(yù)測

在對鹽漬藠頭鹽水細菌類群解析的基礎(chǔ)上，進一步對其基因功能進行了預(yù)測，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，所有序列共注釋到隸屬于23個功能大類的4 305個蛋白質(zhì)直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）。經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，功能E、K、R和S形成1個聚類，即鹽漬藠頭鹽水中細菌具有較強的轉(zhuǎn)錄及氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝功能；其他19個功能形成1個聚類，相關(guān)基因表達功能均較弱。采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，HE Q等[32]研究發(fā)現(xiàn)，藠頭富含8種人體必需氨基酸和5種半必需氨基酸，兩者累計含量占總氨基酸的64.9%，這可能是造成鹽漬藠頭鹽水中細菌氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝功能較強的原因。

圖7 基因功能預(yù)測熱圖Fig.7 Heatmap of gene functional prediction

3 結(jié)論

通過MiSeq高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，來鳳地區(qū)鹽漬藠頭鹽水中優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對含量分別為43.94%、33.12%和18.21%；優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和嗜熱油菌屬（Thermoleophilum），平均相對含量分別為30.28%、18.21%和16.13%；共有219個核心操作分類單元（OTU），包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的75.56%；鹽漬藠頭鹽水中可能共有大量具有較強氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝功能的細菌類群。