血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化性心血管病可檢測到的最早期病理改變，被認(rèn)為是心血管事件的獨立預(yù)測因子[1-2]。如今心血管病已是造成我國居民死亡和疾病負(fù)擔(dān)的首要原因[3-4]，開展人群血管內(nèi)皮功能障礙的篩查對于識別心血管病早期危險個體及其早期預(yù)防具有重要的現(xiàn)實意義。目前血管內(nèi)皮功能可靠的無創(chuàng)性評價方法是通過超聲測量肱動脈血流介導(dǎo)的血管舒張功能（FMD）[5]，但FMD 檢測需要專業(yè)人員進(jìn)行操作，對現(xiàn)場檢測環(huán)境和受檢者要求較高[6]，并且在現(xiàn)場檢測耗時較長等，導(dǎo)致其在一些人群現(xiàn)場調(diào)查中的實施可行性較低。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮功能障礙與內(nèi)皮細(xì)胞代謝密切相關(guān)[7-8]，代謝產(chǎn)物如血清尿酸的改變可提示機體血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生[9]。為此，本研究基于氣相色譜—飛行時間質(zhì)譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC-TOF-MS）技術(shù)的非靶標(biāo)代謝組，檢測血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清代謝物。利用血清差異代謝物構(gòu)建血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測模型并進(jìn)行驗證，為識別人群中血管內(nèi)皮功能障礙的個體提供一種參考方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象

于2015 年在廣西壯族自治區(qū)兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)現(xiàn)場招募常住居民795 名。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）禁食至少8 h；（2）年齡18～80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有冠心病、外周動脈疾病、腦卒中（22 例）；（2）近3 天服用血管舒張藥、降血脂藥或其他藥物（253 例）；（3）FMD 缺失（7 例）。排除282 人后，兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)共納入513 名居民，將其中一個鄉(xiāng)鎮(zhèn)383 名居民按血管內(nèi)皮功能不同狀態(tài)（FMD＜6%為血管內(nèi)皮功能障礙，F(xiàn)MD≥6%為血管內(nèi)皮功能正常[10]）分為兩類，按照年齡和性別進(jìn)行整體匹配，最后共納入77 名居民作為建模組，用以模型構(gòu)建；從另一鄉(xiāng)鎮(zhèn)130 名居民中抽取26 名作為外驗證組，用以模型外部驗證。共納入103 例研究對象。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批（批準(zhǔn)文號：20130306-2），所有研究對象均已被告知研究目的與內(nèi)容并同意參加研究。

1.2 調(diào)查方法

經(jīng)由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查人員對研究對象進(jìn)行問卷調(diào)查、體格檢查和血樣采集。問卷調(diào)查收集研究對象性別、年齡、吸煙、飲酒情況等基本信息，體格檢查獲取身高、體重、血壓，F(xiàn)MD 等資料?，F(xiàn)場采集研究對象外周靜脈血4～5 ml，分離血清后，置于-80℃冰箱保存。

1.3 肱動脈FMD 檢測

以超聲測量的肱動脈FMD 為金標(biāo)準(zhǔn)評價研究對象血管內(nèi)皮功能。FMD 檢測遵循《內(nèi)皮依賴性血流介導(dǎo)的肱動脈血管舒張的超聲評估指南》[6]，采用血管內(nèi)皮功能檢測儀（UNEXEF38G，日本）在室溫、安靜、光線較暗的環(huán)境下進(jìn)行檢測。受檢者靜坐休息至少15 min 后進(jìn)行檢測。檢測時，受檢者處于平臥位，暴露右上臂。將血壓計袖帶縛于右上臂，H 型探頭置于右側(cè)手臂肘上約5～10 cm 的肱動脈部位，測量安靜狀態(tài)下肱動脈基礎(chǔ)直徑，記為D0。保持探頭位置不變，將血壓計袖帶加壓至高于收縮壓50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以阻斷血流，5 min后放開袖帶，測量袖帶放開后30～120 s 內(nèi)反應(yīng)性充血最大擴張直徑，記為D1。FMD=[（D1-D0）/D0]×100%。

1.4 血清代謝物測定

代謝物測定參考文獻(xiàn)[11]的方法，取100 μl 血清于1.5 ml 離心管中，加入350 μl 甲醇和20 μl L-2-氯苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)），混勻，在4℃下以13 000 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min。取400 μl 上清于2 ml 經(jīng)甲烷硅基化的進(jìn)樣瓶中。每個樣本各取4 μl 于新進(jìn)樣瓶中，混勻，作為質(zhì)控樣本。真空干燥樣本后，加入50 μl甲氧胺鹽（溶于吡啶，20 mg/ml），輕輕混勻后，置于80℃烘箱中孵育30 min。隨后向樣本中加入70 μl N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含體積比為1%的三甲基氯硅烷），混勻后在70℃烘箱中孵育2 h，將樣本冷卻至室溫。向質(zhì)控樣本中加入10 μl 飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液（溶于氯仿C8-C16:1 mg/ml；C18-C24:0.5 mg/ml），混勻。

樣本采用Agilent 7890 GC-TOF-MS（Agilent公司，美國）進(jìn)行檢測，采用不分流模式，進(jìn)樣量1 μl，載氣為氦氣。前進(jìn)樣口吹掃流速3 ml/min，柱流速1 ml/min。柱溫：50℃保持1 min，以20℃每分鐘的速率上升至310℃，保持6 min。前進(jìn)樣口和傳輸線溫度分別為280℃和270℃。離子源溫度220℃，電離電壓-70 eV，掃描方式50～500 m/z，掃描速率20 pectra/s，溶劑延遲366 s。

應(yīng)用Chroma TOF 4.3X 軟件和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫對色譜峰進(jìn)行提取、數(shù)據(jù)基線過濾和校正、峰對齊、反卷積分析、峰定性和半定量。采用保留時間指數(shù)方法進(jìn)行峰定性，保留時間定性偏差為5 000，采用內(nèi)標(biāo)歸一化法進(jìn)行峰定量。通過LECO/Fiehn 代謝組學(xué)庫對代謝物進(jìn)行鑒定，相似度越高表明代謝物鑒定越準(zhǔn)確。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Stata 13.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

采用SIMCA 14.1 軟件對建模組代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA），并用200 次置換檢驗判斷OPLS-DA 模型是否過度擬合，由此篩選出血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection,VIP）值大于1 且兩獨立樣本t檢驗的P值＜0.05。以血管內(nèi)皮功能是否障礙為因變量（FMD≥6%=0，F(xiàn)MD＜6%=1），以不同的代謝物（經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換的相對定量值即代謝物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比）組合分別與性別（女=0，男=1）、年齡（連續(xù)型變量）作為自變量構(gòu)建多個Logistic 回歸模型。采用AUC 和Hosmer-Lemeshow 擬合優(yōu)度檢驗，評價所有Logistic 回歸模型的預(yù)測能力和校準(zhǔn)能力，以ROC 曲線中最靠近左上角的點為模型最佳截斷點。

利用建模組數(shù)據(jù)采用十折交叉驗證法對模型進(jìn)行內(nèi)部驗證，外部驗證是采用預(yù)測模型對外驗證組的研究對象進(jìn)行預(yù)測，分別計算AUC、敏感度和特異度以評價模型預(yù)測能力。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者基本特征（表1）

本研究共納入103 例研究對象，其中建模組77例，平均年齡（57.0±6.5）歲，男性37 例（48.1%）；外驗證組26 例，平均年齡（57.0±7.0）歲，男性14例（53.8%）。

表1 兩組受試者基本特征［例（%）］

對建模組和外驗證組受試者的血管內(nèi)皮功能障礙者和血管內(nèi)皮功能正常者進(jìn)行均衡性檢驗。表1顯示，兩組中血管內(nèi)皮功能障礙者和血管內(nèi)皮功能正常者在性別、年齡、民族、教育程度、吸煙情況、飲酒情況、高血壓、糖尿病和體重指數(shù)（BMI）方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.2 PCA 與OPLS-DA 分析結(jié)果

建模組代謝數(shù)據(jù)的PCA 分析結(jié)果顯示，血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的得分點存在小部分重疊，區(qū)分較顯著。為了獲得更好的組間分離，進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA 分析。由圖1 可看出，所有樣本均處于95%CI 內(nèi)，兩組樣本得分點完全區(qū)分，表明這兩類人群的代謝特征有區(qū)別。OPLSDA 模型解釋率（R2Y）和預(yù)測率（Q2）分別為0.949和0.720，置換檢驗R2和Q2截距分別為0.825和-0.437，表明OPLS-DA 模型可以很好地解釋血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者之間的差異性，且不存在過度擬合現(xiàn)象。

圖1 建模組正交偏最小二乘法-判別分析得分圖（n=77）

2.3 建模組中血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物（表2）

根據(jù)建模組OPLS-DA 分析得出的VIP 值，結(jié)合兩獨立樣本t檢驗，篩選出血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物共16 個。與血管內(nèi)皮功能正常者相比，血管內(nèi)皮功能障礙者的尿酸、色氨酸、松香酸、蔗糖、果糖、花生酸、β-胸苷、谷氨酸、棕櫚油酸、2-甲基戊酸、百里香酚水平相對降低（變化倍數(shù)＜1），而尿素、阿拉伯糖醇、尿苷、胞苷酸、來蘇糖酸,1,4-內(nèi)脂的水平相對升高（變化倍數(shù)＞1）。

2.4 預(yù)測模型建立與評價（表3）

通過構(gòu)建不同Logistic 回歸模型并進(jìn)行評價與比較，按功效最優(yōu)原則，其中由性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組合的模型在模型構(gòu)建、內(nèi)部驗證和外部驗證時的AUC 值均較大，且擬合優(yōu)度檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明該模型的預(yù)測能力和校準(zhǔn)能力均較好，確定為本研究預(yù)測模型。模型表達(dá)式為P=1/{1+exp[-（9.803-0.777×性別-0.204×年齡-0.343×ln 尿酸+0.024×ln 色氨酸+0.808×ln尿素）]}，其中P為發(fā)生血管內(nèi)皮功能障礙的概率預(yù)測值。

預(yù)測模型AUC 為0.974，95%CI 為0.945～1.000。以ROC 曲線中最靠近左上角的點為模型最佳截斷點，其對應(yīng)的概率預(yù)測值為0.666，敏感度和特異度分別為93.8%和93.3%。

表2 建模組中血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物

表3 建模組中血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物組合及模型構(gòu)建

2.5 預(yù)測模型驗證

建模組十折交叉驗證（內(nèi)部驗證）平均AUC 為0.922（95%CI：0.847～0.997），敏感度和特異度分別為87.5%和91.1%（圖2）。十折交叉驗證AUC 與模型構(gòu)建AUC 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.07），提示預(yù)測模型具有良好的穩(wěn)定性。

運用建立的預(yù)測模型對外部驗證組26 例受試者進(jìn)行血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測。若P值≥0.666，則判定為血管內(nèi)皮功能障礙，反之則判定為血管內(nèi)皮功能正常。在金標(biāo)準(zhǔn)判定的12 例血管內(nèi)皮功能障礙者中，模型判定正確11 例，錯分為血管內(nèi)皮功能正常者1 例；在金標(biāo)準(zhǔn)判定的14 例血管內(nèi)皮功能正常者中，模型判定正確11 例，錯分為血管內(nèi)皮功能障礙者3 例。外部驗證AUC 為0.881（95%CI：0.729～1.000），敏感度和特異度分別為91.7%和78.6%（圖2），表明模型的預(yù)測能力較好。

圖2 預(yù)測模型內(nèi)部驗證和外部驗證散點圖

3 討論

血管內(nèi)皮功能障礙的分子病理主要表現(xiàn)為一氧化氮（NO）生物利用度降低[12]，并常伴隨氧化應(yīng)激增加和炎癥反應(yīng)[13]。尿素是鳥氨酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物，由精氨酸酶催化精氨酸生成。研究已表明，在動脈粥樣硬化等以血管內(nèi)皮功能障礙為特征的疾病中，精氨酸酶活性增強[14-15]，尿素合成增多，而NO 合酶利用精氨酸生成NO 減少。尿酸是體內(nèi)一種強抗氧化劑，能清除自由基，維持抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的活性[9]。此外，尿酸可與過氧亞硝酸鹽結(jié)合，防止NO 合酶必需輔酶因子—四氫生物蝶呤被氧化[16]。有研究報道，低水平尿酸可能通過增加氧化應(yīng)激和減少NO 生成而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[17]。色氨酸是人體必需氨基酸，在體內(nèi)主要通過犬尿氨酸途徑分解代謝。吲哚胺2,3 雙加氧酶（IDO）是控制色氨酸代謝的限速酶[18]。有研究表明，IDO 在炎癥反應(yīng)中上調(diào)[19]，色氨酸分解代謝增強，致其水平降低。因而，血清尿素、尿酸及色氨酸的改變可能與血管內(nèi)皮功能障礙的分子病理有關(guān)。

血管內(nèi)皮功能評價方法分為有創(chuàng)性和無創(chuàng)性，有創(chuàng)性方法包括冠狀動脈內(nèi)注入血管活性物質(zhì)，血管內(nèi)超聲等。此類方法可直接評估內(nèi)皮功能，測量結(jié)果可靠，但因為是有創(chuàng)操作并且設(shè)備昂貴，使其廣泛應(yīng)用受到限制[20]。目前血管內(nèi)皮功能評價主要以無創(chuàng)性方法為主，常用的方法主要包括FMD，外周動脈張力測定法（peripheral arterial tonometry,PAT），脈搏波傳導(dǎo)速度（PWV）檢測。FMD 檢測因具有無創(chuàng)性、安全性、可重復(fù)性的特點，以及對心血管病具有較好的預(yù)測價值而成為最常用的無創(chuàng)技術(shù)手段，但同時該檢測也存在設(shè)備昂貴、對操作者要求高、操作較為復(fù)雜與費時等不足[20-21]。PAT 的技術(shù)原理與FMD 相似，具有自動化檢測和對操作者依賴性小的優(yōu)勢，不足之處在于易受外界環(huán)境和自主神經(jīng)張力的影響[22]，檢測的敏感度和重復(fù)性不如FMD[23]。PWV 是通過測量體表兩個動脈搏動點之間的搏動傳導(dǎo)速度評價內(nèi)皮功能，該方法操作簡便，自動化程度高，但其檢測過程費時，重復(fù)性較低[24]。

雖然評價血管內(nèi)皮功能的方法眾多，但尚未有一種方法能同時滿足群體性現(xiàn)場調(diào)查中簡便、省時、不易受外界環(huán)境干擾的需求。目前也尚未發(fā)現(xiàn)對血管內(nèi)皮功能障礙進(jìn)行預(yù)測的相關(guān)報道。本研究通過GC-TOF-MS 技術(shù)檢測血清中代謝物，建立了由性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組成的血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測模型，模型總體上具有較好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。GC-TOF-MS 技術(shù)可同時對多樣本多組分進(jìn)行檢測，樣本平均檢測時間和檢測成本均較低。在實際應(yīng)用中，只需獲取血液樣本進(jìn)行檢測即可預(yù)測，在一定程度上減少了對現(xiàn)場檢測環(huán)境的依賴。

本研究存在以下不足。首先，用于模型構(gòu)建和驗證的樣本量較少，將來預(yù)測模型仍需要更大的樣本量在不同特征的群體中進(jìn)行驗證。其次，本次研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)為18～80 歲人群，但實際入組研究對象的平均年齡為（57.0±6.6）歲，并且主要是鄉(xiāng)鎮(zhèn)居民，因此該預(yù)測模型在應(yīng)用于年齡較小人群或城市居民時，可能存在一定的局限性。

綜上所述，本研究構(gòu)建的以性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組合的血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測模型具有良好的穩(wěn)定性和較強的預(yù)測能力。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突