邢建永　周紅　吳正軍　韓正洲　王瑀　姚輝

摘要 目的：應(yīng)用中藥材DNA條形碼鑒定體系核心序列ITS2對九里香藥材及其混偽品進(jìn)行鑒定研究。方法：按照中藥材DNA條形碼分子鑒定法標(biāo)準(zhǔn)流程獲取九里香藥材及其混偽品ITS2序列，進(jìn)行種內(nèi)和種間變異分析，采用最近距離法、SNPs位點(diǎn)分析以及建樹法，綜合評估該序列的鑒定能力。結(jié)果：九里香藥材及其近緣物種ITS2序列長度220～234 bp，基于K2P遺傳距離不能有效區(qū)分九里香、千里香和翼葉九里香，序列分析發(fā)現(xiàn)九里香Murraya exotica與其他物種有3個(gè)穩(wěn)定的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，在UPGMA樹中，不同物種的樣品聚在一起，表明ITS2序列可以區(qū)分九里香藥材及其近緣物種。利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對44份千里香待檢樣品進(jìn)行BLAST鑒定，結(jié)果均為正品千里香。結(jié)論：ITS2序列可用于九里香及其同屬近緣物種的鑒定，為九里香藥材的市場監(jiān)控提供了有效手段，為其本草基因組學(xué)研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 九里香藥材;ITS2;鑒定;蕓香科;近緣種;DNA條形碼;單核苷酸多態(tài)性;本草基因組學(xué)

Abstract Objective：Murrayae Folium et Cacumen and its closely related species were identified by the ITS2 sequence which was the core barcode in the DNA barcoding system for identification of Chinese medicine.Methods：ITS2 sequence of Murrayae Folium et Cacumen，medicinal material and their mixed fakes were identified according to the standard procedure of Chinese medicine DNA barcode molecular identification method，and intra-and inter-specific variation analysis was performed.The nearest distance method，SNPs locus analysis，and tree building method are used to comprehensively evaluate the identification of the sequence ability.Results：The ITS2 sequence lengths of Murrayae Folium et Cacumen and its closely related species were ranged from 220 bp to 234 bp.The results indicated that K2P genetic distance analysis cannot effectively authenticate M.exotica，M.paniculata and M.alata.Sequence analysis found Murraya exotica and other related species have 3 stable SNPs location and in the UPGMA tree，it was shown that different species can be differentiated according to their monophy，indicating that ITS2 sequence can differentiate Murrayae Folium et Cacumen and its closely related species.A total of 44 samples of Murraya paniculata to be inspected were identified based on the DNA Barcoding System showing that that the inspected samples were all authentic.Conclusion：ITS2 sequence can be used to distinguish Murrayae Folium et Cacumen from its closely related species，which provide useful ways for market monitoring of Murrayae Folium et Cacumen and benefit to its herbgenomics research.

Keywords Murrayae Folium et Cacumen; ITS2; Identification; Rutaceae; Closely related species; DNA barcode; SNP; Herbgenomics

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.009

蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya Koenig ex L.）由Koenig ex Linn發(fā)表于1771年[1]。目前，該屬在全世界約有12種，分布于亞洲熱帶、亞熱帶及澳大利亞東北部。我國有9種及1變種，主要分布于廣東、廣西、海南、臺灣、福建、湖南、貴州、云南等地[2]。該屬植物不僅花香濃烈，持久，花色潔白美麗，樹形端正，四季常青，而且渾身都是寶，被廣泛地應(yīng)用于日常生活中，尤其在醫(yī)療、花卉、香料及調(diào)味料等行業(yè)應(yīng)用頗多[3-4]。例如，2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）[5]收載的中藥材九里香Murrayae Folium et Cacumen為蕓香科九里香屬植物九里香Murraya exotica L.和千里香Murraya paniculata（L.）Jack的干燥葉和帶葉嫩枝，具有行氣止痛、活血散瘀的功效，常用于治療胃痛、風(fēng)濕痹痛、牙痛、跌撲腫痛、蟲蛇咬傷等，是著名中成藥“三九胃泰”的主藥之一[1]。1977年版《中國藥典》曾收載過，1985、1990年版《中國藥典》未收載，1995年版《中國藥典》[6]重新收入。又如，豆葉九里香M.euchrestifolia曾被用于治療感冒、咳嗽、氣喘和發(fā)熱等[1，7];而調(diào)料九里香M.koenigii則是一種著名的咖哩粉調(diào)料，除此之外，其根及莖皮也有一定的藥用價(jià)值，具有驅(qū)蟲、止痛、消炎、醒腦提神等功效，可用于治療銀屑病、血液病、皮膚病及腎病等[8]。廣西九里香M.kwangsiensis因枝葉中含有的豐富精油，被加工成香精[9]。

前人對九里香屬植物的分類及藥材基原物種進(jìn)行了研究。黃成就[10]于1959年對國產(chǎn)九里香屬植物的分類進(jìn)行了總結(jié)，認(rèn)為我國有6種及2變種;1978年，他又對該屬植物的分類進(jìn)行了修訂[11]。《中國高等植物圖鑒（補(bǔ)編）》[12]中重新收錄我國本屬共有8種1變種?！陡＝ㄖ参镏尽贰稄V東植物志》《浙江植物志》中收載的九里香學(xué)名為M.exotica;而《中國樹木分類學(xué)》將九里香的學(xué)名定為M.paniculata，將M.exotica視為其異名;《福建藥物志》《全國中草藥匯編》《中藥大辭典》和《中國木本藥用植物》等均將九里香學(xué)名定為M.paniculata。由于此屬物種拉丁名的變更，物種名稱較為混亂，可能導(dǎo)致其應(yīng)用的混亂。且此屬植物使用較為廣泛，不同物種所含化學(xué)成分又不盡相同，故亟需一種準(zhǔn)確、高效的方法對該屬不同物種進(jìn)行鑒定。鄒聯(lián)新等[13]利用掃描電鏡技術(shù)對九里香屬9種植物葉表面微細(xì)特征進(jìn)行了比較觀察，為該屬的分類提供新的資料。

作為本草基因組學(xué)的重要組成部分，DNA條形碼技術(shù)因其鑒定方法不受個(gè)體形態(tài)特征限制、不受個(gè)體發(fā)育階段影響、從基因水平上客觀區(qū)分物種、操作方法相對簡便等特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注[14]。目前，中藥材DNA條形碼鑒定體系已被納入《中國藥典》，在藥用植物基原物種[15]、藥材[16]、種子[17]、超微破壁飲片[18]、中成藥[19]等鑒定中已有廣泛應(yīng)用。羅焜等[20]證實(shí)了ITS2在蕓香科植物中亦具有較高的鑒定效率。本研究基于ITS2序列對九里香屬8個(gè)種99份樣品進(jìn)行研究，旨在考察ITS2序列對該屬物種的鑒定區(qū)分能力，為其高效、準(zhǔn)確的鑒定提供一種新方法。

1 材料

本研究涉及蕓香科九里香屬的8個(gè)物種共99份研究對象，其中實(shí)驗(yàn)樣本79份，GenBank下載序列20條。實(shí)驗(yàn)樣本包括基原植物帶葉嫩枝、種子、市售藥材、對照藥材和復(fù)核樣本?；参锊勺詮V西、廣東、福建、海南、云南、四川、貴州、越南等地，并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。對照藥材（以“FDC”為編號）來自中國食品藥品檢定研究院。復(fù)核樣本（以“RC”為編號）由深圳市藥品檢驗(yàn)所、湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院和中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行復(fù)核。樣本信息見表1。

2 方法

2.1 總DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序 參照2015年版《中國藥典》（四部）“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”[21]獲取九里香及其近緣物種ITS2序列。

2.2 數(shù)據(jù)處理 將正反向測序結(jié)果應(yīng)用CodonCode Aligner V 3.7.1（CodonCode Co.，USA）進(jìn)行拼接并去除引物區(qū)，為確保DNA條形碼序列的可靠性，去除測序結(jié)構(gòu)兩端信號弱或重疊峰區(qū)域，序列方向與PCR擴(kuò)增正向產(chǎn)物方向一致，對上述拼接得到的DNA序列使用Koetschan等[22]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列。將所有序列用軟件MEGA6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）分析[23]，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析，用算術(shù)平均數(shù)的非加權(quán)成組配對法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS2序列信息及分析 實(shí)驗(yàn)獲得九里香屬藥用植物ITS2序列共99條，注釋后序列長度為220～234 bp，平均GC含量為72.5%～75.6%。35條九里香M.exotica序列，見圖1，高度保守，暫未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。38條千里香M.paniculata序列，見圖1，和14條調(diào)料九里香M.koenigii序列分別存在8個(gè)變異位點(diǎn)，并分別獲得10種和5種不同的單倍型。2條翼葉九里香M.alata的序列完全一致，暫未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。4條小葉九里香M.microphylla序列共存在6個(gè)變異位點(diǎn)，獲得了2種單倍型。4條廣西九里香M.kwangsiensis序列僅在190 bp處出現(xiàn)了C-G變異，獲得2種不同單倍型。詳細(xì)序列信息見表2。

3.2 種內(nèi)種間遺傳距離分析 實(shí)驗(yàn)獲得九里香屬藥用植物ITS2序列共98條，應(yīng)用MEGA 6.0軟件，基于K2P遺傳距離模型對各種九里香屬植物的ITS2序列進(jìn)行種內(nèi)種間變異分析。九里香M.exotica的種內(nèi)遺傳距離為0，千里香M.paniculata的種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.018。千里香M.paniculata和九里香M.exotica的種間最小遺傳距離為0.014，千里香M.paniculata和翼葉九里香M.alata的種間最小遺傳距離為0.005，它們均小于千里香M.paniculata的種內(nèi)最大遺傳距離0.018。

因此，基于K2P遺傳距離結(jié)果不能有效區(qū)分千里香、九里香和翼葉九里香這3個(gè)物種。見表3。

3.3 SNP位點(diǎn)分析 SNP（Single-nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記是由DNA序列中單個(gè)堿基的變異引起的遺傳多態(tài)性，突變頻率高，是基因組分布密度最高的標(biāo)記[24]。SNP包括2種形式，堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，具有分布廣泛、數(shù)量巨大、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，基因編碼區(qū)的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平等優(yōu)點(diǎn)，而且也易于自動快速檢測和自動化分析，是研究復(fù)雜遺傳性狀和基因組進(jìn)化的理想標(biāo)記。目前該技術(shù)已被應(yīng)用于動植物物種鑒定和中藥材鑒定中[25-28]。本研究分析比較了23條九里香屬植物ITS2序列單倍型，并進(jìn)行SNP位點(diǎn)的初步查找。發(fā)現(xiàn)九里香M.exotica的ITS2序列中存在3個(gè)穩(wěn)定的SNP標(biāo)記，即第75位的核苷酸T、第109位的核苷酸T和第173位的核苷酸A，這3個(gè)SNP位點(diǎn)可用于藥用植物九里香M.exotica的快速分子鑒定。見圖2。

3.4 UPGMA聚類樹分析 基于ITS2序列單倍型構(gòu)建九里香藥材及其近緣物種UPGMA系統(tǒng)聚類樹，結(jié)果顯示，九里香屬不同物種均顯示出單系性，九里香、千里香和翼葉九里香也分別聚為不同支。因此基于UPGMA樹分析，ITS2序列能夠區(qū)分九里香屬不同的物種。見圖3。

3.5 利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對千里香待檢樣品進(jìn)行鑒定 在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中對44份待檢千里香樣品進(jìn)行BLAST鑒定，結(jié)果表明44份待檢千里香樣品均為《中國藥典》規(guī)定的正品來源，相關(guān)樣品信息及鑒定結(jié)果見表4。

4 討論

本草基因組學(xué)是利用組學(xué)技術(shù)研究中藥基原物種的遺傳信息及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一門學(xué)科，本草基因組學(xué)研究產(chǎn)生的序列信息庫能夠?yàn)樗幉姆肿訕?biāo)記提供豐富的基因資源[29]，DNA條形碼是當(dāng)前國際上最受關(guān)注的分子標(biāo)記。陳士林等[30]通過大量研究建立了以ITS2為核心、以psbA-trnH為輔助的中草藥DNA條形碼物種鑒定體系，為中藥材鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則》[21]為DNA條形碼技術(shù)的行業(yè)應(yīng)用提供了參考。DNA條形碼鑒定方法在中藥材基原物種鑒定中已有廣泛應(yīng)用[15-18，20]，并拓展至中成藥基原物種的鑒定中[19]。本研究基于DNA條形碼核心序列ITS2對蕓香科九里香藥材及其近緣物種進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示ITS2序列可以鑒定九里香藥材基原物種及其混偽品，基于ITS2序列對44份待檢千里香樣品進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示待檢千里香樣品均為《中國藥典》規(guī)定的正品來源，為保障其安全用藥提供了依據(jù)。

SNP分子標(biāo)記是繼以SSR、ISSR為代表的第二代分子標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的第三代分子標(biāo)記技術(shù)[31-32]，是個(gè)體差異在DNA水平的反映，其在動植物基因組中分布廣泛，信息豐富且易于檢測。這種可遺傳變異的特性，使得SNP分子標(biāo)記技術(shù)在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。Chen等[25]已經(jīng)把SNP鑒定技術(shù)應(yīng)用于中藥材人參、西洋參的鑒定中，并取得成功。王麗麗等[26]利用SNP快速準(zhǔn)確鑒定了藏菖蒲。除此之外，焦文靜等[27]基于SNP位點(diǎn)成功區(qū)分了陽春砂、海南砂和綠殼砂，趙丹等[28]基于ITS2序列SNP位點(diǎn)鑒定了白及藥材及其混偽品。這些研究進(jìn)一步說明SNP位點(diǎn)的解析是分析種間差異小的種群的一種重要手段。本研究中，我們通過SNP位點(diǎn)查找，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)穩(wěn)定的SNP標(biāo)記存在于九里香M.exotica的ITS2序列中，其可用于藥用植物九里香M.exotica的快速分子鑒定。此外，我們還分別發(fā)現(xiàn)九里香、千里香和翼葉九里香的ITS2序列中存在4個(gè)變異位點(diǎn)。但是由于翼葉九里香的樣本量相對較少，這些變異位點(diǎn)是否可作為SNP標(biāo)記用于物種鑒定還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（2020-02-10收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）