關(guān)少培 羅 茜 吳建軍 卞兆連

肝細(xì)胞癌(HCC)是常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球第5位，是全球男性第2位致死性疾病[1]。中國(guó)是HCC高發(fā)的國(guó)家，江蘇南通等東部沿海地區(qū)是中國(guó)的HCC高發(fā)地區(qū)[2]。由于HCC起病隱匿，惡性程度高，病情進(jìn)展快，極易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，故多數(shù)患者確診時(shí)已處于中、晚期。目前HCC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，乙型肝炎病毒(HBV)感染、乙醇、遺傳等因素都與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。臨床上常規(guī)對(duì)手術(shù)中切除的HCC組織標(biāo)本進(jìn)行p53等分子的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以期判斷預(yù)后，但這些分子的敏感度、特異度不高，預(yù)后判斷效果并不理想。因此，研究HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找潛在的預(yù)后標(biāo)志物顯得尤為重要。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有共價(jià)閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，因缺乏5′端和3′端，故circRNA比一般的線性RNA更穩(wěn)定，不易被降解。根據(jù)基因組和序列組成的來(lái)源，circRNA分為3類：外顯子circRNA(ecircRNA)、內(nèi)含子circRNA(ciRNA)及外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)[4]。近年來(lái)的研究表明circRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括HCC、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等[5-8]。

Hsa_circ_0012839來(lái)源于PGM1基因的第9、10號(hào)外顯子，屬于ecircRNA，位于chr1∶64117339-64120137，長(zhǎng)度為319 bp。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法分析組織、細(xì)胞中hsa_circ_0012839的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)合患者術(shù)后隨訪資料，初步分析其表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系，判斷其作為潛在預(yù)后標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集2013年9月至2018年3月在南通市第三人民醫(yī)院肝膽外科被確診為肝細(xì)胞癌(HCC)并經(jīng)手術(shù)切除的48例患者的腫瘤組織及癌旁正常組織(距離腫瘤切緣>1 cm)，其中男性36例，女性12例，平均年齡(58.38±11.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)后病理確診為HCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病歷資料不完整；(2)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)合并其他臟器嚴(yán)重功能不全；(4)隨訪時(shí)間<6個(gè)月。

所有組織標(biāo)本離體0.5 h內(nèi)浸泡于RNA later中，過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。正常肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞和5種HCC細(xì)胞系(Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細(xì)胞)購(gòu)自上海中科院干細(xì)胞庫(kù)，由南通市肝病研究所培養(yǎng)并傳代；RPMI-1640、高糖DMEM、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Cell Sciences公司；RNAiso Plus試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

收集患者的臨床資料，隨訪術(shù)后患者，記錄患者的生存狀況。所有患者均隨訪至2018年9月或死亡。 所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 瓊脂糖凝膠電泳

配置1%瓊脂糖凝膠，室溫下靜置至完全凝固，移液器吸取樣本加至每孔內(nèi)，加樣后立即通電進(jìn)行電泳，電壓80 V，樣品由負(fù)極向正極流動(dòng)，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)至距離膠板下緣1 cm時(shí)停止電泳，于紫外線下采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3 總RNA的提取及qRT-PCR檢測(cè)

使用RNAiso Plus抽提HCC組織、癌旁正常組織以及L-02、Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細(xì)胞中總RNA后，應(yīng)用NanoDrop-One分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)在冰上配制反應(yīng)體系。輕柔混勻后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冷卻至4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用qRT-PCR法檢測(cè)hsa_circ_0012839的相對(duì)表達(dá)水平，反應(yīng)條件：第一步預(yù)變性，95 ℃ 30 s；第二步PCR，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct表示計(jì)算結(jié)果。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用IBM SPSS Statistics 24及GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsa_circ_0012839的成環(huán)性分析

應(yīng)用背靠背、頭碰頭引物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析hsa_circ_0012839的成環(huán)性。背靠背引物只可擴(kuò)增環(huán)狀分子，頭碰頭引物既可擴(kuò)增環(huán)狀分子，也可擴(kuò)增線性分子。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，hsa_circ_0012839既可被背靠背引物擴(kuò)增，也可被頭碰頭引物擴(kuò)增，而GAPDH為線性內(nèi)參，只能被頭碰頭引物擴(kuò)增，不能被背靠背引物擴(kuò)增，表明hsa_circ_0012839為環(huán)狀RNA。見(jiàn)圖1。

注：背為背靠背引物，頭為頭碰頭引物，cDNA為拷貝DNA，gDNA為基因組DNA

2.2 Hsa_circ_0012839在HCC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較

通過(guò)qRT-PCR法測(cè)得HCC組織和癌旁正常組織中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平分別為0.51±0.50和4.94±9.91，HCC組織中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見(jiàn)圖2。

圖2 Hsa_circ_0012839在HCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較

2.3 Hsa_circ_0012839在細(xì)胞中的表達(dá)水平比較

通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞相比，5種HCC細(xì)胞系Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中PLC/PRF/5細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平最高，Hep3B細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平最低。見(jiàn)圖3。

注：與L-02細(xì)胞相比，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

2.4 Hsa_circ_0012839表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)hsa_circ_0012839的相對(duì)表達(dá)量(HCC組織/配對(duì)癌旁組織)，以比值=0.122 3為界限將HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，與高表達(dá)組相比，hsa_circ_0012839低表達(dá)組的預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011 6)。見(jiàn)圖4。

圖4 Hsa_circ_0012839表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

二代測(cè)序的普及推進(jìn)了RNA研究領(lǐng)域的快速發(fā)展。CircRNA在腫瘤基因組學(xué)中備受關(guān)注[9]。研究表明circRNA通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞核中，由于circRNA與親本DNA存在重復(fù)序列，故當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)circRNA累積量增多時(shí)，滯留在核內(nèi)的circRNA會(huì)以“負(fù)反饋”的方式與親本DNA形成RNA︰DNA雜合鏈，直接阻斷線性同源轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致可變剪接的發(fā)生，從而改變基因的表達(dá)[10]。在細(xì)胞質(zhì)中，circRNA的表達(dá)也參與了細(xì)胞基因的調(diào)節(jié)。諸多研究均已證實(shí)，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過(guò)充當(dāng)miRNA海綿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[11]。細(xì)胞質(zhì)中的circRNA還可以與不同的蛋白質(zhì)相互作用形成特定的circRNA，繼而影響結(jié)合蛋白的作用方式，如circMbl、circFOXO3、circANRIL[12-14]。另有研究報(bào)道RNA甲基化(m6A)也可驅(qū)動(dòng)circRNA翻譯成多肽[15]，但翻譯效率目前仍受較大限制。

在細(xì)胞外，CircRNA是很有前景的生物學(xué)標(biāo)志物。CircRNA因其環(huán)狀閉合抗RNase的特點(diǎn)而被視為非常好的生物標(biāo)志物。其在某些細(xì)胞分泌的外泌體中大量存在，發(fā)揮著細(xì)胞間通信的作用[16]。盡管circRNA能否在遠(yuǎn)處組織和內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮生物學(xué)作用尚待研究，但其仍有作為潛在生物學(xué)標(biāo)志物的研究?jī)r(jià)值。

近年來(lái)諸多研究表明，非編碼RNA尤其是circRNA的表達(dá)失衡可影響HCC的發(fā)生、發(fā)展，circRNA在HCC的進(jìn)展中起著促癌或抑癌的作用。Yu等[17]通過(guò)RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，由于受到DExH-Box螺旋酶的調(diào)控，cSMARCA5在HCC組織中低表達(dá)，cSMARCA5低表達(dá)的患者的術(shù)后總體生存率較低，腫瘤復(fù)發(fā)率較高。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，cSMARCA5通過(guò)海綿吸附miR-17-3p和miR-181b-5p，下調(diào)TIMP3的表達(dá)，從而抑制HCC細(xì)胞的增殖及遷移能力，提示cSMARCA5與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。Zheng等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0079929在HCC中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0079929時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)展也受阻，進(jìn)一步研究顯示hsa_circ_0079929通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制了細(xì)胞增殖。此外，有些circRNA在HCC中起促癌因子的作用。Huang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-100338在HCC組織中高表達(dá)，乙型肝炎相關(guān)性HCC患者的5年生存率較低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高。Wang等[20]的研究表明，circRHOT1在HCC組織中表達(dá)上調(diào)并與較差的預(yù)后有關(guān)。體內(nèi)和體外研究顯示，circRHOT1通過(guò)觸發(fā)NR2F6的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。上述研究表明circRNA參與HCC的多種生物學(xué)行為，circRNA具有潛在的作為生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究?jī)r(jià)值。

本研究應(yīng)用背靠背、頭碰頭引物，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果證明了hsa_circ_0012839為環(huán)狀RNA。采用qRT-PCR法檢測(cè)HCC組織和癌旁正常組織中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平，結(jié)果顯示前者低于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。隨后采用qRT-PCR法檢測(cè)了各細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比于正常肝細(xì)胞系L-02細(xì)胞，5種HCC細(xì)胞系(Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細(xì)胞)中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，其中PLC/PRF/5細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平最高，Hep3B細(xì)胞中hsa_circ_0012839的表達(dá)水平最低?；仡櫺苑治鯤CC術(shù)后患者的預(yù)后情況，相比于hsa_circ_0012839高表達(dá)組，hsa_circ_0012839低表達(dá)組的預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011 6)。本研究結(jié)果表明，hsa_circ_0012839參與調(diào)控HCC的發(fā)生、發(fā)展，是判斷HCC患者預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，但調(diào)控的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。