張 群 李 濤 張禮杏

門靜脈高壓是肝硬化患者較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可誘發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血、頑固性腹水、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、脾功能亢進(jìn)及肝性腦病等，甚至可導(dǎo)致死亡[1-3]。門靜脈壓力在肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后評(píng)估中具有重要意義[4]。肝靜脈壓力梯度與門靜脈壓力梯度有較高的相關(guān)性，被認(rèn)為是反映門靜脈壓力的金標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。但由于肝靜脈壓力梯度檢查為有創(chuàng)性檢查，且費(fèi)用昂貴，暫未在臨床上推廣應(yīng)用[7]。因此，探究反映肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的生物標(biāo)志物意義重大。有研究表明，miR-26b過表達(dá)可靶向人類平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，抑制Rho亞家族蛋白A/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)，降低經(jīng)膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝硬化門靜脈高壓大鼠的門靜脈壓力，并改善肝纖維化[8]。目前關(guān)于miR-26b在肝硬化門靜脈高壓患者血清中的表達(dá)水平及其與預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。本文對(duì)此開展研究，以期為肝硬化門靜脈高壓的預(yù)后評(píng)估提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2018年12月在太和縣中醫(yī)院確診為肝硬化門靜脈高壓的127例患者作為研究對(duì)象。參照《肝硬化門靜脈高壓食管胃靜脈曲張出血防治指南(2015)》[9]對(duì)患者進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有慢性乙型肝炎病毒、慢性丙型肝炎病毒感染史，感染時(shí)間長于6個(gè)月；(2)首次經(jīng)影像學(xué)檢查或肝活組織病理學(xué)檢查確診為肝硬化，并伴有門靜脈高壓；(3)簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)門靜脈高壓性胃腸病；(2)嚴(yán)重肝、腎功能障礙；(3)合并嚴(yán)重感染；(4)先天性肝內(nèi)膽管囊性擴(kuò)張或膽道阻塞性擴(kuò)張；(5)合并惡性腫瘤。127例肝硬化門靜脈高壓患者中男性85例，女性42例，年齡為28～70歲，平均年齡為(53.59±8.54)歲；其中慢性乙型肝炎患者114例，慢性丙型肝炎患者13例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集

收集受試者的年齡、性別、肝硬化病因、Child-Pugh分級(jí)、肌酐、白蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和膽紅素水平。采用7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)檢測肌酐水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測ALT和AST水平，采用免疫比濁法檢測白蛋白水平，采用釩酸鹽氧化法檢測膽紅素水平。

1.3 血清miR-26b表達(dá)水平檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測所有患者血清中miR-26b的表達(dá)水平[10]。步驟如下：(1)抽取患者晨起肘部靜脈血10 mL，3 500 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，提取離心后上清液；(2)將Trizol試劑滴加至上清液中，提取血清中總RNA；(3)用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度；(4)將總RNA加至Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲取cDNA；(5)用PCR儀擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，之后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-26b的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 預(yù)后隨訪及評(píng)價(jià)

采用電話隨訪、復(fù)診等方式了解肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后情況。于患者出院后1個(gè)月開始隨訪，末次隨訪時(shí)間為2019年12月23日。本研究將食管胃底靜脈曲張破裂出血、中量或高量腹腔積液(>500 mL)、自發(fā)性腹膜炎、肝性腦病及上述并發(fā)癥誘發(fā)的死亡定義為預(yù)后不良。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的基本資料比較

127例肝硬化門靜脈高壓患者中共有53例(41.73%)預(yù)后不良，其中食管胃底靜脈曲張破裂出血44例(34.65%)，中量腹腔積液5例(3.94%)，高量腹腔積液2例(1.57%)，并發(fā)自發(fā)性腹膜炎2例(1.57%)。兩組患者在性別、白蛋白、ALT和AST水平方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。預(yù)后不良組患者的年齡、慢性丙型肝炎占比、Child-Pugh分級(jí)B級(jí)占比、肌酐和膽紅素水平均高于預(yù)后不良組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組的基本資料比較

2.2 兩組血清中miR-26b表達(dá)水平比較

預(yù)后不良組患者血清中miR-26b相對(duì)表達(dá)量為4.30±1.29，低于預(yù)后良好組(6.31±1.56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.691，P<0.001)。

2.3 miR-26b評(píng)估肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的價(jià)值

miR-26b評(píng)估肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的ROC曲線下面積(AUC)為0.838(95%CI：0.762～0.898)，最大約登指數(shù)為0.520，其所對(duì)應(yīng)的最佳截?cái)帱c(diǎn)、敏感度和特異度分別為4.52、64.15%和87.84%。見圖1。

2.4 影響肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

將肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后情況作為因變量，將可能影響肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的相關(guān)因素如年齡、肝硬化病因、Child-Pugh分級(jí)、肌酐、膽紅素和miR-26b相對(duì)表達(dá)量作為自變量納入多因素Logistic回歸分析(納入標(biāo)準(zhǔn)為單因素分析中P<0.05)，結(jié)果顯示年齡、肝硬化病因、Child-Pugh分級(jí)及miR-26b相對(duì)表達(dá)量與肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05)，見表3。

圖1 miR-26b評(píng)估肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的ROC曲線

表3 影響肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討論

微RNA(miRNA)是一類由18～24個(gè)核苷酸組成的不具備編碼蛋白質(zhì)功能的單鏈RNA[11]。據(jù)報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA可參與細(xì)胞的增殖、自噬、遷移及凋亡等病理生理過程[12-14]。miR-26b作為miRNA中一員，已被報(bào)道其與乳腺癌[15]、肺癌[16]、上皮性卵巢癌[17]和黑素瘤[18]等有關(guān)。Jiang等[19]研究證實(shí)了miR-26b可抑制Mcl-1基因表達(dá)，加速腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于miR-26b與肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測肝硬化門靜脈高壓患者血清miR-26b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組患者血清中miR-26b的相對(duì)表達(dá)量低于預(yù)后良好組，提示血清miR-26b的表達(dá)水平可能與肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后密切相關(guān)。隨后，本研究構(gòu)建了miR-26b診斷肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示miR-26b評(píng)估肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的ROC AUC、敏感度和特異度分別為0.838、64.15%和87.84%，提示miR-26b對(duì)肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后評(píng)估具有較高價(jià)值，特異度較高，但敏感度較低。為進(jìn)一步明確miR-26b與肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的關(guān)系，本研究采用單因素及多因素Logistic回歸分析了可能影響肝硬化門靜脈高壓患者預(yù)后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示年齡、肝硬化病因、Child-Pugh分級(jí)及miR-26b相對(duì)表達(dá)量與肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后密切相關(guān)。周昊等[4]研究表明年齡≥60歲或伴有慢性丙型肝炎的肝硬化門靜脈高壓患者的門靜脈壓力較高，推測患者預(yù)后不良的原因可能是年齡較大或伴有慢性丙型肝炎肝硬化，兩者均會(huì)升高門靜脈壓力，易誘發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病等并發(fā)癥。Child-Pugh分級(jí)可反映肝臟的損傷情況，對(duì)肝硬化患者的預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值[20]。miR-26b相對(duì)表達(dá)量與肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后密切相關(guān)，推測其原因是miR-26b過表達(dá)可降低膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝硬化門靜脈高壓大鼠的門靜脈壓力，從而改善肝硬化[8]，其表達(dá)水平可反映肝臟損傷情況，進(jìn)而預(yù)示患者預(yù)后。

綜上所述，肝硬化門靜脈高壓預(yù)后不良患者的血清miR-26b表達(dá)水平低于預(yù)后良好者。檢測肝硬化門靜脈高壓患者血清miR-26b表達(dá)水平有助于評(píng)估預(yù)后情況。年齡較大、患有慢性丙型肝炎、Child-Pugh分級(jí)為B級(jí)或miR-26b表達(dá)水平較低的肝硬化門靜脈高壓患者的預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高。本研究的不足之處在于為單中心研究，納入的患者均為本地區(qū)患者，可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定偏倚，下一步將納入多地區(qū)患者，開展多中心研究。