盧言菊， 趙振東， 畢良武， 陳玉湘*， 王 婧， 古 研

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042； 2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

天然產(chǎn)物是新藥的重要來源，特別是在抗腫瘤和降血壓領(lǐng)域[1-2]。對天然產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造獲得低毒和環(huán)境友好的生物活性制劑已經(jīng)成為天然產(chǎn)物研究的重要方向，也是開發(fā)新型農(nóng)藥和醫(yī)藥的重要研究內(nèi)容。松香是我國重要的天然產(chǎn)物，異海松酸是其重要成分之一，異海松酸分子中C13位有一個甲基和一個乙烯基，分子中不存在共軛雙鍵，這一特殊結(jié)構(gòu)使得異海松酸及其衍生物都具有較好的生物活性；基于異海松酸獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及其較強(qiáng)的生物活性優(yōu)勢，使得異海松酸在殺蟲、抗腫瘤、抑菌、激活鉀離子通道、抗病毒和抗結(jié)核等方面表現(xiàn)出明顯的效果，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3-5]。將具有生物活性的結(jié)構(gòu)單元拼接到異海松酸結(jié)構(gòu)上，會對異海松酸的生物活性具有加強(qiáng)作用?；酋０奉惢衔锉旧硪簿哂休^好的生物活性，對于磺酰胺類衍生物的制備及其應(yīng)用，國內(nèi)外專家進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果表明：磺酰胺類化合物具有廣泛的抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等生物活性[6-8]。岑波等[9]以α-蒎烯為原料制備得到α-蒎烯基苯基磺酰胺類化合物，此類化合物對黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥赤霉病菌以及番茄早疫病菌等 5種植物病原菌都具有較好的抑制活性；Wilkinson等[10]制備了含1,2,3-三唑結(jié)構(gòu)的磺酰胺類化合物，此類化合物對結(jié)核分枝桿菌具有顯著的抑制活性；Hu等[11]制備了咔唑類磺酰胺化合物，并將其應(yīng)用于人白血病細(xì)胞的抑制活性測定，結(jié)果表明：該類化合物對白血病細(xì)胞表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制活性，有望應(yīng)用于白血病治療藥物的研發(fā)；馬獻(xiàn)力等[12]制備了11個新型樟腦酸基苯磺酰胺類化合物，通過生物活性測試驗(yàn)證了大部分化合物均具有一定的抑菌活性；唐燕玲等[13]合成了8個未見報(bào)道的 3-芳基-5-噻吩基二氫吡唑磺酰胺衍生物，研究表明：部分該類化合物具有潛在的體外抗炎活性。作者課題組前期的研究表明異海松酸?；交蓟酋０奉惢衔镉休^好的抗腫瘤活性，鑒于噻吩類磺酰胺化合物具有更好的抗腫瘤活性，本研究擬利用活性拼接原理將含有噻吩的磺酰胺類化合物引入到異海松酸結(jié)構(gòu)中，成功地合成了4種未見報(bào)道的異海松?；绶灶惢酋０?，并對其進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，以期為新藥研發(fā)提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

異海松酸，自制[14]；4-溴-2,5-二氯噻吩-3-磺酰氯、5-溴噻吩-2-磺酰氯、5-氯- 4-硝基噻吩-2-磺酰氯、噻吩-2-磺酰氯均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析純；三乙胺，分析純。人體宮頸癌細(xì)胞(Hela)、乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、前列腺癌細(xì)胞(PC-3)和肝癌細(xì)胞(Hep G2)，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；KGM12800型DMEM培養(yǎng)基，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2 異海松酰基噻吩類磺酰胺化合物的合成

1.2.1合成路線 異海松?；s環(huán)類磺酰胺化合物的合成路線如圖1所示。

1.2.2異海松酸酰氯(2)的制備 在冰浴下充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，將草酰氯的二氯甲烷溶液滴加到異海松酸(1)的二氯甲烷溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑后得到淡黃色液體即為異海松酸酰氯(2)。

1.2.3化合物5a～5d的制備 將一定量的對苯二胺(3)、三乙胺和四氫呋喃加入燒瓶中，攪拌溶解，隨后，將雜環(huán)磺酰氯溶解于四氫呋喃中，緩慢滴加到反應(yīng)燒瓶中，常溫反應(yīng)1～2 h，TLC跟蹤反應(yīng)終點(diǎn)，得到中間產(chǎn)物(4)；隨后將1.2.2節(jié)制備的異海松酸酰氯(2)溶解于四氫呋喃溶液中，在冰浴下滴加至上述反應(yīng)燒瓶中，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)2～5 h，TLC跟蹤反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去生成的三乙胺鹽酸鹽，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到固體粗產(chǎn)品，再經(jīng)重結(jié)晶得產(chǎn)物5a～5d。

1.3 產(chǎn)物抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1細(xì)胞株培養(yǎng) 將待測人體腫瘤細(xì)胞株用胰蛋白酶-EDTA(0.25%)消化液消化后，與10%的胎牛血清、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液，置于37 ℃，5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4天傳代一次。

圖1 異海松?；绶灶惢酋０费苌锏暮铣陕肪€

1.3.2受試化合物溶液的配制 用DMSO分別配制100 mmol/L異海松酸噻吩類磺酰胺化合物母液，液體樣品經(jīng)稀釋配置成100和10 μmol/L的待測液。

1.3.3抑制活性測試 采用噻唑藍(lán)(MTT)法測試化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性[15]。細(xì)胞經(jīng)消化、計(jì)數(shù)，配制細(xì)胞懸液(3.5×107個/L)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；將提前配制好的不同濃度的待測化合物溶液加入到96孔板的每個微孔中，每孔100 μL，繼續(xù)置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL(5 g/L)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解，搖床振蕩10 min 混勻，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值(A)。根據(jù)下式計(jì)算樣品的抑制率：

式中：η—抑制率，%；Ac—對照值；As—實(shí)驗(yàn)值；Ab—空白值。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

2.2 目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性測試

2.2.1抑制率 采用MTT 法分別測定了異海松?；绶灶惢酋０坊衔镌跐舛葹?00 和10 μmol/L時(shí)對人體宮頸癌(Hela)、乳腺癌(MDA-MB-231)、前列腺癌(PC-3)和肝癌(Hep G2)這4種人體腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性，結(jié)果見表1。

表1 異海松?；绶灶惢酋０坊衔飳δ[瘤細(xì)胞的抑制率Table 1 Inhibitory rates of isopimaric thiophene sulfonamides derivatives against cancer cell lines

從表1可以看出，當(dāng)異海松?；绶灶惢酋０坊衔锏臐舛葹?00 μmol/L時(shí)，化合物5b對Hela、MDA-MB-231及Hep G2腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率均超過90%，其抑制率分別為91.36%、94.06%和92.26%，而對PC-3腫瘤細(xì)胞的抑制率為86.93%，也接近90%，說明化合物5b具有非常好的抗腫瘤活性；但化合物5a、5c和5d對4種人體腫瘤細(xì)胞的抑制率較差，均低于25%。當(dāng)異海松?；绶灶惢酋０坊衔锏臐舛葹?0 μmol/L時(shí)，化合物5a～5d對4種人體腫瘤細(xì)胞的抑制率均較低，抗腫瘤效果不明顯，說明藥物濃度對抗腫瘤活性具有較大的影響。將表1的體外抗腫瘤活性進(jìn)行初步構(gòu)效關(guān)系分析，化合物5a的噻吩環(huán)上引入了1個溴原子和2個氯原子，其對4種腫瘤細(xì)胞的抑制率較低；化合物5b的噻吩環(huán)上引入了1個溴原子，其對4種腫瘤細(xì)胞的抑制率顯著提高；化合物5c的噻吩環(huán)上引入了1個氯原子的同時(shí)還引入了1個硝基，其對4種腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯下降；而未有鹵素原子引入的化合物5d，其抗腫瘤活性也較差。因此，可以看出噻吩環(huán)上取代基的種類以及取代位置，對化合物的抗腫瘤活性具有較大的影響。

2.2.2半數(shù)抑制濃度 根據(jù)表1中各化合物對4種人體腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性的測定結(jié)果，選取抗腫瘤活性較好的化合物5b運(yùn)用 MTT 比色法測定其半數(shù)抑制濃度(IC50)值，并選用高效、廣譜的天然產(chǎn)物抗癌劑紫杉醇和臨床上應(yīng)用較廣的抗癌劑5-氟尿嘧啶(5-FU)作為陽性對照，結(jié)果見表2。

表2 異海松酰基雜環(huán)磺酰胺類化合物對腫瘤細(xì)胞的IC50值Table 2 IC50 values of isopimaric heterocyclic sulfonamides derivatives against cancer cell lines

從表2可以看出，化合物5b顯示出較高的抗腫瘤活性，對人體腫瘤細(xì)胞Hela、 MDA-MB-231、 PC-3和Hep G2的IC50值分別為28.53、 32.54、 32.93和29.22 μmol/L，均低于陽性對照物5-FU，說明化合物5b的抑制效果優(yōu)于陽性對照物5-FU；同時(shí)化合物5b對Hela的抑制活性優(yōu)于天然產(chǎn)物抗癌劑紫杉醇，可作為抗腫瘤藥物篩選參考。

3 結(jié) 論

3.1以異海松酸為原料，制備得到4個未見報(bào)道的異海松酰基噻吩類磺酰胺化合物：異海松?；? 4-溴-2,5-二氯噻吩-3-磺酰胺(5a)、異海松?；?5-溴噻吩-2-磺酰胺(5b)、異海松?；?5-氯- 4-硝基噻吩-2-磺酰胺(5c)、異海松?；?噻吩-2-磺酰胺(5d)，并采用FT-IR、1H NMR、13C NMR和ESI-MS等方法對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。

3.2選用人體宮頸癌(Hela)、乳腺癌(MDA-MB-231)、前列腺癌(PC-3)和肝癌(Hep G2)這4種人體腫瘤細(xì)胞研究了目標(biāo)化合物的體外抗腫瘤活性，采用MTT 法分別測定了異海松酰基噻吩類磺酰胺化合物在濃度為100和10 μmol/L時(shí)對人體腫瘤細(xì)胞的抑制率。結(jié)果表明：化合物5b具有非常好的抗腫瘤活性，其對Hela、 MDA-MB-231及Hep G2的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率均超過90%，噻吩環(huán)上取代基的種類及取代位置對化合物的抗腫瘤活性具有較大的影響，通過IC50值的測定得出化合物5b的抑制效果優(yōu)于陽性對照物臨床上應(yīng)用較廣的抗癌劑5-氟尿嘧啶(5-FU)。這些結(jié)果對后續(xù)異海松酸磺酰胺類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與改造研究具有重要的指導(dǎo)意義。