郭鵬飛 方堅(jiān)松 劉艾林

摘要 目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索“生脈散（SMS）”用于新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）恢復(fù)期治療的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。方法：結(jié)合中華人民共和國藥典并從TCMSP、在線分析平臺(tái)（ETCM、TCMID、HIT）以及Chemdb數(shù)據(jù)庫搜索SMS復(fù)方中每味中藥的歸經(jīng)和成分。藥物成分潛在靶標(biāo)通過PharmMapper、DrugBank、E-TCM和Swiss Target Prediction 4個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測。然后，運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SMS藥物成分靶標(biāo)與COVID-19之間靶蛋白相互作用關(guān)系的分析，接著利用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析。最后用DAVID和FunRich數(shù)據(jù)庫對候選靶標(biāo)進(jìn)行富集分析。結(jié)果：生脈散里的3味中藥均歸屬于肺經(jīng)，從生脈散復(fù)方中共篩選出21個(gè)符合選擇標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)成分，主要包括常見的皂苷類化學(xué)成分如人參皂苷Rh4、醇類化學(xué)成分如β-谷甾醇，木脂素類化學(xué)成分如五味子素，另外還有生物堿類、黃酮類和萜類等化學(xué)成分。預(yù)測得到中藥化學(xué)成分相關(guān)靶標(biāo)457個(gè)，COVID-19靶標(biāo)51個(gè)。通過String分析發(fā)現(xiàn)，化學(xué)成分中的70個(gè)靶標(biāo)與COVID-19的29個(gè)靶標(biāo)之間存在著緊密的相互作用;通路富集分析表明，候選靶標(biāo)富集的通路主要包括癌癥相關(guān)的多條通路、FoxO信號(hào)通路、病毒致癌作用信號(hào)通路等。結(jié)論：SMS中的有效活性成分可能通過作用于CUL2、NUP62、RAE1等多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來起到抑制新型冠狀病毒肺炎作用，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究提供重要信息依據(jù)。

關(guān)鍵詞 新型冠狀病毒肺炎;生脈散;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);候選靶標(biāo);富集分析

Abstract Objective：To explore the material basis and mechanism of Shengmai San （SMS） in the treatment of COVID-19 during the recovery period using network pharmacology. Methods：The meridian tropism and composition of each herb in SMS were searched from TCMSP， online analysis platform （ETCM， TCMID， HIT）， Chemdb database and chinese pharmacopoeia. Then， PharmMapper database， DrugBank， E-TCM and Swiss Target Prediction platforms were used to predict potential targets of components of SMS. The interaction between proteins of SMS drug components and the key targets of COVID-19 were analyzed by using String database， Cytoscape software was used for network construction and analysis. Finally， DAVID platform and FunRich databases were used for enrichment analysis of candidate targets. Results：It was found that the meridian tropism of the three Chinese herbs in SMS are all lung meridian. A total of 21 chemical components that meet the screen standard were selected from the SMS compound， including common saponin compounds such as ginsenoside Rh4， alcohol compounds such as β-sitosterol， lignan compounds such as schisandrin， and other chemical components such as alkaloids， flavonoids and terpenes. In addition， 457 targets related to the chemical compositions from SMS were predicted， and 51 targets related with COVID-19 disease were obtained. String analysis found that there were close interactions between the 70 targets of the chemical components and the 29 targets of COVID-19; The pathway enrichment analysis showed that the pathways enriched by candidate targets mainly included multiple cancer-related pathways， FoxO signaling pathway， viral carcinogenesis signaling pathway， etc. Conclusion：This paper preliminarily explored the material basis and action mechanism of SMS for the treatment of COVID-19 during the recovery period based on network pharmacology. These results will provide important information for further study.

Keywords COVID-19; Shengmai San （SMS）; Network pharmacology; Candidate target; Enrichment analysis

中圖分類號(hào)：R289.4;R563文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.001

目前全球暴發(fā)的一種新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的以呼吸道感染為主要特征的傳染性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳和乏力等癥狀，目前尚無治療特效藥物。該病毒具有潛伏期長、傳染性強(qiáng)、各類人群普遍易感等特點(diǎn)[1-4]。Wrapp等[5]證明SARS-COV-2的S蛋白和ACE2蛋白的結(jié)合強(qiáng)度約為SARS病毒結(jié)合ACE2蛋白的10～20倍。因此，如何形成快速有效的救治方案和研發(fā)有效的藥物來遏制病毒的傳播，是當(dāng)前面臨的重大問題。

在湖北確診病例的臨床治療中，中醫(yī)藥對病毒感染性肺炎表現(xiàn)出來良好的治療療效，且參與率極高。同時(shí)，臨床研究也證明，中藥能夠明顯改善患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力和咽干等癥狀。中藥的治療對于患者的康復(fù)發(fā)揮著不可替代的優(yōu)勢。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》認(rèn)為患者恢復(fù)期為肺脾氣虛證，主要表現(xiàn)為氣短、倦怠乏力、納差嘔惡、痞滿、大便無力、便溏不爽、舌淡胖和苔白膩等癥狀[6]。基于此，生脈散及其制劑作為治療氣陰兩虛證的代表方劑而被廣泛推薦?！蛾兾魇⌒滦凸跔畈《靖腥镜姆窝字嗅t(yī)藥治療方案（試行第二版）》中將生脈制劑作為患者恢復(fù)期輔助治療的主要推薦用藥[7]。《華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院關(guān)于新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)診療方案及預(yù)防方案》報(bào)道，恢復(fù)期患者可采用生脈散合補(bǔ)中益氣丸的聯(lián)合治療，以提高預(yù)防的效果[8]。

生脈散又名生脈飲，由人參、麥冬、五味子3味中藥組成，方中人參補(bǔ)肺益脾以生津;麥冬養(yǎng)陰、消熱以生津;五味子固表止汗而生津。張?jiān)卦凇夺t(yī)學(xué)啟源》中首載此方，朱震亨在《丹溪心法》中確立其治法?！夺t(yī)方考》謂之“一補(bǔ)，一清，一斂，養(yǎng)氣之道備也，名曰“生脈”?！夺t(yī)學(xué)啟源》卷下曰：“補(bǔ)肺中元?dú)獠蛔恪薄Ｒ陨隙颊f明此方在治療肺病方面有足夠的理論支持和依據(jù)[9]。

近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行藥物重定位、利用人工智能（AI）助力藥物研發(fā)以及應(yīng)用深度學(xué)習(xí)方法設(shè)計(jì)疾病蛋白抑制劑等新技術(shù)新方法在藥物研發(fā)的領(lǐng)域越來越扮演著重要的作用。Zhou等[10]利用系統(tǒng)藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)方法系統(tǒng)的預(yù)測了2 000多個(gè)FDA批準(zhǔn)的藥物，篩選出了16種人類冠狀病毒（HCoVs）的候選藥物和3種潛在的藥物組合，對于防治COVID-19老藥新用的臨床前研究和藥物組發(fā)現(xiàn)有一定的指導(dǎo)價(jià)值和意義。Richardson等[11]運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)模型，預(yù)測巴瑞替尼（Baricitinib）可能作為COVID-19急性呼吸系統(tǒng)疾病的潛在治療藥物。徐波研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一個(gè)利用CT圖像輔助診斷新型冠狀病毒肺炎的人工智能模型。該模型鑒別新冠肺炎與其他病毒性肺炎的總準(zhǔn)確率可達(dá)83%，且快速高效[12]。

我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從分子水平探索SMS用于治療COVID-19恢復(fù)期的機(jī)制。首先，通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫的挖掘并篩選SMS包含有效化學(xué)成分和它們對應(yīng)的靶標(biāo)，基于文獻(xiàn)來總結(jié)COVID-19靶標(biāo)的最新研究成果。然后，構(gòu)建和分析藥物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，確定網(wǎng)絡(luò)中的候選靶標(biāo)并對關(guān)鍵靶標(biāo)的分子功能、生物學(xué)過程以及通路等進(jìn)行富集分析。最后，結(jié)合已有的藥理學(xué)文獻(xiàn)來探討其中的機(jī)制，以期對生脈散用于治療SARS-CoV-2感染患者恢復(fù)期的康復(fù)有所幫助和參考。

1 資料與方法

1.1 資料

從ETCM[13]（TCM-MESH[14]、HIT[15]、TCM-ID[16]）、TCMSP[17]和Chemdb數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn.[1978-2020]Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS）中獲取復(fù)方SMS所含3味中藥的歸經(jīng)及包含的化學(xué)成分。

1.2 方法

1.2.1 生脈散中藥化學(xué)成分的收集 從ETCM[13]（TCM-MESH[14]、HIT[15]、TCM-ID[16]）、TCMSP[17]和Chemdb數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn.[1978-2020]Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS）中獲取復(fù)方SMS所含3味中藥的歸經(jīng)及包含的化學(xué)成分，把所有的化學(xué)成分輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行口服生物利用度（OB），藥物分子的類藥性（DL）和人腸細(xì)胞株滲透性（Caco-2）的篩選。其中，OB表示口服藥物有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并被吸收的速度與程度。DL說明藥物生物活性分子的類藥性。Caco-2用作研究藥物在腸道上皮中被動(dòng)擴(kuò)散的有效體外模型，我們使用Caco-2單層細(xì)胞中成分的轉(zhuǎn)運(yùn)速率（nm/s）來表示腸上皮滲透性。接著把收集到的所有化學(xué)成分在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找化學(xué)成分對應(yīng)的CAS號(hào)（PubMed ID）。

1.2.2 生脈散中藥化學(xué)成分靶標(biāo)的預(yù)測 根據(jù)化學(xué)成分的名稱從ETCM、PharmMapper[18]、TCMSP和Swiss Target Prediction[19]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶標(biāo)的預(yù)測。其中，ETCM里的靶標(biāo)是用化合物設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)分析軟件（MedChem Studio）預(yù)測且只保留可靠性數(shù)值大于0.8的靶標(biāo);PharmMapper預(yù)測的靶標(biāo)選擇（Norm_Fit）>0.7作為預(yù)測的靶標(biāo);TCMSP選擇符合隨機(jī)森林算法（Random Forest algorithm：http：//www.stat.berkeley.edu/users/breiman）閾值≥0.8和支持向量機(jī)閾值（Support Vector Machine Score）≥0.7作為候選靶標(biāo);Swiss Target Prediction預(yù)測的靶標(biāo)選擇置信度（Probability）>0作為候選靶標(biāo).

1.2.3 疾病靶標(biāo)的確定 本研究主要通過文獻(xiàn)進(jìn)行檢索和匯總來確定疾病的靶標(biāo)集。主要的方法包括藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、快速篩查B譜系β冠狀病毒受體結(jié)合域的方法、親和純化質(zhì)譜（AP-MS）[20-24]。

1.2.4 靶標(biāo)蛋白基因名的標(biāo)準(zhǔn)化及化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將預(yù)測到的化學(xué)成分和COVID-19的靶標(biāo)運(yùn)用UniProt（https：//www.uniprot.org/）和GeneCards[25]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名的標(biāo)準(zhǔn)化，選擇屬性為人源蛋白。所有標(biāo)準(zhǔn)化后的靶標(biāo)刪除重復(fù)項(xiàng)之后分別作為作為藥物靶標(biāo)集和COVID-19的靶標(biāo)集。然后，運(yùn)用Cytoscape 3.2.1[26]軟件構(gòu)建和分析藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和候選靶點(diǎn)的篩選 為進(jìn)一步明確潛在藥物成分靶標(biāo)和COVID-19靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將篩選出來的化學(xué)成分靶點(diǎn)和COVID-19潛在的靶標(biāo)導(dǎo)入String網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)[27]，選擇最高的置信度（Highest_confidence）≥0.9作為條件進(jìn)行PPI篩選，最終獲得與COVID-19潛在蛋白的互作關(guān)系，并保存為TSV格式文件。將結(jié)果“#node1，node2”信息導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件中，構(gòu)建藥物活性成分靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 候選靶點(diǎn)的通路分析 為了進(jìn)一步探討PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出來候選靶標(biāo)的分子功能、生物學(xué)過程、信號(hào)通路等機(jī)制，將篩選得到靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫[28]進(jìn)行KEGG富集分析[29]，輸入靶基因名稱列表限定物種為“Homo Sapiens”，所有靶基因名稱校正為“Official Gene Symbol”。并同時(shí)運(yùn)用FunRich數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路、分子功能、和靶標(biāo)歸經(jīng)等富集分析[30]，運(yùn)用在線繪圖網(wǎng)站OmiShare Tools將其結(jié)果可視化[31]。

2 結(jié)果

2.1 SMS復(fù)方中有效成分的篩選結(jié)果 通過多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫的檢索和收集，最后獲得SMS復(fù)方中麥冬、人參和五味子中的化學(xué)成分共711個(gè)，其中80個(gè)來自麥冬，375個(gè)來自人參，256個(gè)來自五味子。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18，Caco-2>-0.4為標(biāo)準(zhǔn)篩選出化學(xué)成分21個(gè)，其中2個(gè)來自麥冬，13個(gè)來自人參，8個(gè)來自五味子，其中人參和麥冬共有一個(gè)活性成分stigmasterol，人參和五味子共有一個(gè)成分 deoxyharringtonine。SMS中篩選的活性化學(xué)成分的基本信息見表1。

2.2 化合物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用FunRich數(shù)據(jù)庫對預(yù)測到的457個(gè)化學(xué)成分靶標(biāo)進(jìn)行人體表達(dá)部位的富集分析（site of expression），結(jié)果表明，所有預(yù)測的靶標(biāo)中有430個(gè)靶標(biāo)在肺部相對特異性的表達(dá)，表達(dá)部位包括肺、肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡、支氣管上皮細(xì)胞、支氣管肺泡、胎肺、肺成纖維細(xì)胞和支氣管，其他的靶標(biāo)表達(dá)于T細(xì)胞、肝臟、直腸以及膀胱等部位?；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1，圖中共479個(gè)節(jié)點(diǎn)，808條邊，紅色的節(jié)點(diǎn)代表相對特異性表達(dá)于人體肺部的靶標(biāo)，綠色的節(jié)點(diǎn)表示表達(dá)在人體其他組織部位的靶標(biāo)，藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分。以中心度值（Betweenness Centrality）和等級(jí)值（Degree）對化學(xué)成分和靶點(diǎn)進(jìn)行排序，排名前十的化學(xué)成分中心度值從大到小的化合物是 ginsenoside Rh4、dianthramine、gomisin R、arachidonate、kaempferol、beta-sitosterol、stigmasterol、moupinamide、celabenzine和frutinone A。Degree大于5的靶點(diǎn)有HSP90AB1、EGFR、ESR1、ABCB1、AR、CYP3A4和PTGS2等。在網(wǎng)絡(luò)圖中對應(yīng)中心度值的變化與此節(jié)點(diǎn)的邊所連接的Degree值呈正相關(guān)，Degree值越大，表明中心度值越高。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和候選靶標(biāo)的篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建見圖2，圖中共涉及99個(gè)節(jié)點(diǎn)，137條邊。紅色的節(jié)點(diǎn)代表COVID-19靶標(biāo)，藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)代表與COVID-19靶標(biāo)直接相關(guān)的化學(xué)成分靶標(biāo)。最后篩選出來99個(gè)核心靶標(biāo)，見表3。其中，COVID-19靶標(biāo)29個(gè)，藥物活性成分的靶標(biāo)有70個(gè)。COVID-19靶標(biāo)和藥物成分靶標(biāo)相互作用打分前10的靶標(biāo)

對分別是RAE1-NUP214、NUP62-NUPL1、NUP98-NUP54、RAE1-NUP98、RAE1-NUP54、CUL2-VHL、NUP62-NUP214、NUP62-NUP88、NUP62-NUP54和NUP88-NUP214?；瘜W(xué)成分靶標(biāo)和COVID-19靶標(biāo)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)的分值（combined_score）見表2。本研究選擇以上99個(gè)候選靶標(biāo)作為SMS預(yù)防和治療COVID-19恢復(fù)期的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4 候選靶標(biāo)的KEGG富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對99個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG功能富集分析，最后富集得到77條信號(hào)通路（P<0.05），涉及傳染病的通路有9條：Tuberculosis（hsa05152：P=1.5×10-3）、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection（hsa05120：P=9.2×10-3）、Toxoplasmosis（hsa05145：P=0.046）、Influenza A（hsa05164：P=1.24×10-6）、Hepatitis B（hsa05161：P=3.93×10-4）、Hepatitis C（hsa05160：P=1.2×10-3）、Epstein-Barr virus infection（hsa05169：P=3.8×10-3）、Measles（hsa05162：P=5.9×10-3）和Herpes simplex infection（hsa05169：P=0.025）。涉及的基因有MAPK1、CEBPB、EP300、ATP6AP1、MAPK14、CREBBP、RAF1、JAK2、SRC等。將上述的通路輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路的系統(tǒng)分類，以上9條通路都屬傳染病系統(tǒng)，其他通路的歸屬見表4。

2.5 候選靶標(biāo)的FunRich富集分析 本研究選擇富集結(jié)果最顯著的前20個(gè)條目進(jìn)行分析，分析結(jié)果集中于生物學(xué)過程，涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗凋亡、酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、能量途徑、炎性反應(yīng)、蛋白水解和肽水解、蛋白質(zhì)修飾等;分子功能集中于蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、激酶結(jié)合、半乳糖苷酶活性、羧肽酶活性、氧化還原酶活性、配體依賴性核受體活性等多種蛋白酶的活性;細(xì)胞組分中所涉及細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、核孔、線粒體、溶酶體、核包膜、Sin3復(fù)合體、組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物等組分;通路富集分析主要集中于HDAC I類介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、雄激素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、整合素相關(guān)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)、IFN-γ通路、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的調(diào)節(jié)、HDAC II類介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、NEP/NS2與細(xì)胞出口機(jī)制的相互作用等。見圖3。

2.6 候選靶標(biāo)歸經(jīng)和臨床表型的分析 歸經(jīng)和臨床表型富集結(jié)果表明，候選的99個(gè)靶標(biāo)中，在肺部相對特異性表達(dá)的靶標(biāo)有AAK1、ABCC1、ACE2、ATP6AP1、AVPR1A、BRD2、BRD4、COMT、CUL2、ERC1等，共88個(gè)，占候選靶標(biāo)總數(shù)的88.9%，說明SMS主要活性成分的靶標(biāo)主要在肺部表達(dá)。同時(shí)，候選靶標(biāo)還在人體的子宮頸、前列腺、子宮內(nèi)膜、肝、直腸、胎盤、宮頸癌、膀胱和睪丸等組織表達(dá)。臨床表型富集分析結(jié)果見圖4。富集結(jié)果提示，SMS作用的候選靶標(biāo)可能參與毛細(xì)血管瘤、紅細(xì)胞增多癥、血細(xì)胞比容增加、血紅蛋白增加、紅細(xì)胞量增加、排尿困難、肺泡細(xì)胞癌、肺癌、急性壞死性腦病和腦干病變等臨床表型來預(yù)防COVID-19和其并發(fā)癥的作用。

3 討論

在此次疫情防治工作中，中醫(yī)藥顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢，也取得了重要的成果。生脈散是治療氣陰兩虛證的經(jīng)典方劑，現(xiàn)在臨床上仍然開發(fā)成多種試劑（包括散劑、顆粒劑、口服液、注射劑等）被廣泛應(yīng)用?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩唬骸胺慰鄽馍夏?，急食苦以泄之”“其瀉以辛，其補(bǔ)以酸”“肺欲收，急食酸以收之”。方中人參味甘而微苦，補(bǔ)脾不膩之良品為君藥。人參并非直接補(bǔ)肺，而是培土以生金，健母以養(yǎng)子耳。而麥冬甘寒，滋養(yǎng)肺陰，生津解渴用以為臣;五味子酸溫，斂肺止汗，生津止渴，為佐藥。三藥合用，一補(bǔ)一潤一斂，益氣養(yǎng)陰，生津止渴，故名“生脈”?，F(xiàn)代研究也證明，生脈散有治療肺部疾病的作用。張心月等[32]通過對博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型的作用研究，發(fā)現(xiàn)人參、麥冬等藥材可能參與機(jī)體炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答，通過減少促炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，最后顯著降低大鼠肺纖維化程度。田野等[33]通過對生脈散的臨床應(yīng)用及其抗肺纖維化和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥理作用進(jìn)行綜述，從而證明生脈散用于新型冠狀病毒肺炎恢復(fù)期治療的可行性。單卓程等[34]認(rèn)為新型冠狀病毒肺炎危重癥期屬內(nèi)閉外脫者，治療方可選生脈散加減。國家中醫(yī)藥管理局新冠肺炎防治方案（第5版）所載治療方藥當(dāng)中，SMS的3味中藥人參、麥冬和五味子都是治療肺病使用頻次最高的首選藥物，其中，人參、五味子常用于補(bǔ)肺法，麥冬常用于清肺法[35]。

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果來看，生脈散的主要活性成分的靶標(biāo)和SARS-CoV-2潛在的靶標(biāo)存在緊密的相互作用關(guān)系。研究表明，在主要的活性成分中，豆甾醇（stigmasterol）可以調(diào)節(jié)卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘豚鼠模型中的過敏性氣道炎性反應(yīng)，具有顯著的抗哮喘特性[36]。β-谷甾醇（beta-sitosterol）是唯一能在納摩爾濃度下顯著抑制銅綠假單胞菌依賴性IL-8表達(dá)的化合物。初步的機(jī)制分析表明，β-谷甾醇可以抑制銅綠假單胞菌依賴性蛋白激酶C亞型的活化，已知該活化作用與跨膜信號(hào)激活支氣管上皮細(xì)胞中IL-8基因的表達(dá)有關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，β-谷甾醇是控制支氣管纖維化患者過度肺部炎性反應(yīng)的分子[37]。同樣，預(yù)測的候選靶標(biāo)在病毒的預(yù)防當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用。Vanessa Monteil等[38]證明臨床級(jí)可溶性人ACE2有效抑制SARS-CoV-2在Vero E6、人血管類器官和人腎臟類器官的感染，或?qū)⒂兄诳刂芐ARS-CoV-2感染。Zhao等[39]對715例受試者（415例，300例對照）使用多因素降維和累積遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方法分析了基因與基因之間的相互作用，最后研究結(jié)果表明，ACE rs4340D/NOS3 rs1799983T的組合有助于中國兒童支原體肺炎性肺炎（MPP）的遺傳易感性。

候選靶標(biāo)的通路富集結(jié)果表明，COVID-19的發(fā)生發(fā)展和特定種類的癌癥、多種細(xì)胞因子的表達(dá)、神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控、機(jī)體免疫反應(yīng)以及破壞人類多能干細(xì)胞密切相關(guān)。

3.1 特定種類的癌癥 Xiaodong Jia等[40]通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)特定種類癌癥更具新冠病毒的易感性，對這些人群作出重點(diǎn)保護(hù)將是防疫工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究中預(yù)測的SMS的主要成分arachidonate、girinimbin、beta-sitosterol和kaempferol都具有減輕肺癌細(xì)胞損傷的作用，揭示了它們潛在預(yù)防COVID-19并發(fā)癥的作用[41-45]。另外，DAVID和FunRich富集分析也發(fā)現(xiàn)候選靶標(biāo)富集在多條癌癥的信號(hào)通路，包括 hsa05200、hsa05203、hsa05205等。見表4。參與的基因有EGFR、PTGER1、AR、HSP90AA1、BRAF、MAP2K1、VHL、CREBBP、PPARG、RAF1、BCL2L1、IGF1R、CUL2等。

3.2 多種細(xì)胞因子的表達(dá) Pei等[46]發(fā)現(xiàn)（SARS-CoV）、（MERS-CoV）以及其他呼吸道病毒如鼻病毒Rhinovirus和甲型流感病毒H1N1均可以誘導(dǎo)COVID-19細(xì)胞受體ACE2的上調(diào)。細(xì)胞因子如干擾素IFN-beta和IFN-gamma也可以刺激ACE2的表達(dá)，這表明SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”不僅可以對人體器官造成損傷還可以促進(jìn)病毒的進(jìn)一步感染和傳播。并推測病毒感染后激活免疫系統(tǒng)并誘導(dǎo)包括IFN在內(nèi)的多種細(xì)胞因子表達(dá)，這些細(xì)胞因子通過其受體激活下游信號(hào)通路來促進(jìn)ACE2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究通過FunRich富集分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)如ABCC1、ERC1、HDAC2、NDUFAF2、NUP214、PRKACA、PTGES2、RIPK1、TMPRSS2等參與干擾素IFN-gamma pathway（P-Value=9.34×10-10）通路。見圖3。

3.3 神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控 Mao等[47]對214名確診為冠狀病毒SARS-CoV-2感染并診斷出為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征（SARS）的住院患者進(jìn)行了研究，其中88位（41.1%）為重度患者，126位（58.9%）為非重度患者。研究發(fā)現(xiàn)，與非嚴(yán)重的COVID-19患者相比，嚴(yán)重的患者通常具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，具體表現(xiàn)為急性腦血管疾病，意識(shí)障礙和骨骼肌癥狀。因此，對于COVID-19患者，除了呼吸系統(tǒng)癥狀外，醫(yī)生還應(yīng)密切注意任何神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn);Xu等[48]從一名有明顯中樞神經(jīng)癥狀的SARS患者的尸體解剖獲得的腦組織樣本中成功分離出SARS-CoV株;Lau等[49]從一名SARS患者的腦脊液樣本中也檢測出SARS冠狀病毒（SARS-CoV），表明SARS-CoV可能導(dǎo)致了中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的感染。本研究中，KEGG和FunRich通路富集分析結(jié)果均提示，藥物作用的關(guān)鍵靶標(biāo)參與多條神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控，其中KEGG的調(diào)控通路有 hsa00590（Arachidonic acid metabolism）、hsa04720（Long-term potentiation）hsa04726（Serotonergic synapse）、hsa04722（Neurotrophin signaling pathway）、hsa04730（Long-term depression）、hsa04725（Cholinergic synapse），涉及的基因有CBR1、PTGES2、PTGES、HPGDS、MAPK1、EP300、BRAF、MAP2K1、CREBBP、RAF1、PRKACA等。FunRich富集得到的神經(jīng)相關(guān)通路如Neurotrophic factor-mediated Trk receptor signaling，參與的基因有DNM1、PIK3CA、YWHAE、PRKCZ、MAPK1、RAF1、SRC、BRAF、MAP2K1、MAPK14等。

3.4 機(jī)體免疫反應(yīng) 近日，Grifoni等[50]首次分析了針對新型冠狀病毒的機(jī)體有效免疫反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞和T細(xì)胞表位在SARS-CoV-2和SARS-CoV之間具有高度保守性，靶向作用這些區(qū)域的疫苗策略或許能夠幫助機(jī)體產(chǎn)生特殊的免疫力，不僅能提供交叉感染的保護(hù)能力，還能有效抵御病毒未來的進(jìn)化。KEGG通路富集分析也表明，新冠病毒與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，如 hsa04611（Platelet activation）、hsa04062（Chemokine signaling pathway）、hsa04664（Fc epsilon RI signaling pathway）、hsa04620（Toll-like receptor signaling pathway）、hsa04660（T cell receptor signaling pathway）。涉及的基因有MAPK1、PRKCZ、MAPK14、PIK3CA、PRKACA、NOS3、SRC、ITGA2B等。

3.5 破壞人類多能干細(xì)胞 Lin等[51]研究表明，SARS-CoV-2破壞人類多能干細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，這為SARS-CoV-2的致病機(jī)制提供了新的見識(shí)。在本研究中，通過對候選靶標(biāo)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，基因MAPK1-IGF1R-MAP2K1-MAPK14-RAF1-PIK3CA-JAK2參與調(diào)控 hsa04550（Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）信號(hào)通路。

通過長期的實(shí)踐從療效觀察中總結(jié)，中醫(yī)的辨證用藥講究歸經(jīng)，歸經(jīng)指藥物作用及藥效在人體的臟腑經(jīng)絡(luò)的定位。根據(jù)中醫(yī)理論，SMS復(fù)方中的3味中藥都?xì)w屬于肺經(jīng)，為了證明藥物中的關(guān)鍵成分作用靶標(biāo)的歸屬，F(xiàn)unRich數(shù)據(jù)庫富集說明了候選靶標(biāo)在人體許多組織中的表達(dá)。而目前的臨床研究也證明了靶標(biāo)除了在肺部也可能在人體其他部位表達(dá)。例如，Mengyuan等[52]利用生物信息學(xué)方法研究了ACE2的組織分布，研究表明ACE2除了在肺組織表達(dá)外，還在胃腸道、肝臟、睪丸、腎臟、心臟和甲狀腺等多個(gè)組織高表達(dá)，表明SARS-CoV-2可能會(huì)感染肺以外的其他組織。臨床研究也表明，ACE2在男性的睪丸和女性的胎盤的表達(dá)量非常高。Cai等[53]研究表明，ACE2在睪丸中的表達(dá)量幾乎是人體內(nèi)最高的，并由此推測SARS-CoV-2很可能通過與這些ACE2陽性細(xì)胞結(jié)合，入侵并損傷患者的睪丸組織。Bo等[54]收治85例經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的COVID-19的患者的估計(jì)腎小球?yàn)V過率（eGFR）以及其他臨床參數(shù)進(jìn)行了回顧性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2可誘導(dǎo)COVID-19患者發(fā)生急性腎衰竭（ARF），病毒直接感染人腎小管以引起急性腎小管損傷。Dong等[55]研究報(bào)道了一名攜帶有COVID-19的孕婦分娩出新生兒2 h后，抗體IgM水平升高，細(xì)胞因子測試結(jié)果異常，并出現(xiàn)炎性反應(yīng)和肝損傷的并發(fā)癥狀。IgM抗體水平升高表明該新生兒在子宮感染了病毒，同時(shí)間接支持垂直傳播的可能性;Zeng等[56]發(fā)現(xiàn)在6名確診COVID-19的孕婦中，有2例出生的嬰兒中檢測到IgM（通常不會(huì)從母親轉(zhuǎn)移到胎兒，因?yàn)槠漭^大的大分子結(jié)構(gòu)），這表明也存在母嬰垂直傳播的可能;同時(shí)，Kimberlin等[57]系統(tǒng)總結(jié)了以上2個(gè)研究成果，同時(shí)指出支持SARS-CoV-2的垂直傳播。以上研究證明，SARS-CoV-2主要造成人體肺部的感染，同時(shí)可能引發(fā)多種并發(fā)癥。SMS可能通過調(diào)控多個(gè)靶標(biāo)來預(yù)防和治療COVID-19恢復(fù)期的復(fù)發(fā)以及多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)地研究了SMS治療COVID-19恢復(fù)期的有效成分、潛在作用靶標(biāo)及其網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制，其中部分結(jié)果與最新文獻(xiàn)報(bào)道相一致。SMS的有效成分是其發(fā)揮COVID-19康復(fù)期治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，將為藥物治療的研發(fā)提供有益的信息，關(guān)鍵靶標(biāo)之間相互作用以及其相關(guān)通路研究對于揭示SMS的藥效機(jī)制提供新的思路。

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（2020-05-12收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）