焦亮亮，朱文魁，羅翠平，雷建平

0 引言

糖尿病是一種日益普遍的慢性疾病，主要由缺乏胰島素、高血糖、血脂異常和神經(jīng)血管損傷引起，可損害各個器官系統(tǒng)，影響患者生活質(zhì)量，并帶來嚴重的經(jīng)濟負擔[1-2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變是1型和2型糖尿病的常見并發(fā)癥，在臨床上相對于傳統(tǒng)藥物，新生物標志物會更有利于提高糖尿病視網(wǎng)膜病變的預(yù)后。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質(zhì)細胞的重要中間絲蛋白，其可用來標記中樞神經(jīng)膠質(zhì)細胞各個階段的變化[3-4]，且在糖尿病視網(wǎng)膜病變中具有調(diào)控作用，但是具體的作用機制仍有待研究。轉(zhuǎn)化生長因子-beta(TGF-β)信號通路在人類的很多疾病中均表現(xiàn)出活性異常升高[5-6]，其中包括糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變[7]，TGF-β1和轉(zhuǎn)錄因子Smad2、Smad3、Smad4是TGF-β信號級聯(lián)傳遞的關(guān)鍵蛋白[8-9]。但是GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能機制與TGF-β信號通路之間的關(guān)系尚且未知。本研究擬以高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(hRMECs)為研究對象，檢測慢病毒介導(dǎo)的GFAP基因沉默對高糖誘導(dǎo)hRMECs細胞增殖和凋亡的影響，分析GFAP、TGF-β信號通路關(guān)鍵基因的表達，以揭示GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能，為GFAP用于糖尿病視網(wǎng)膜病變的生物治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料細胞：人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(hRMECs)購自美國Angio-Proteomie公司。主要試劑：D-甘露醇購自Merck公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；TGF-β信號通路特異性激活劑SRI-011381(純度：98%)、CCK-8試劑盒購自美國Glpbio公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購自碧云天公司；鼠抗人GFAP(sc-33673)、TGF-β1(sc-130348)、Smad2(sc-101153)、Smad3(sc-101154)單克隆蛋白抗體以及山羊抗鼠IgG二抗(sc-516102)購于美國Santa Cruz公司。主要儀器設(shè)備：熒光定量PCR儀(7500型)購于美國ABI公司；流式細胞儀(型號CytoFLEX)購于美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將hRMECs用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中，每2～3d傳代一次，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞用于實驗研究。

1.2.2 細胞處理與分組(1)將正常培養(yǎng)的hRMECs用5、30mmol/mL葡萄糖、30mmol/mL D-甘露醇處理24h，分別標記為NG+hRMECs組、HG+hRMECs組、高滲對照組。(2)將高糖誘導(dǎo)(30mmol/mL葡萄糖作用24h)的hRMECs隨機分為sh RNA組、sh GFAP組，分別將sh RNA(5’-GCAGCAACTGGAGGATCTAGA-3’)、sh GFAP(5’-AGGAATTAAGAGAAGCAACAT-3’)目的片段進行pGCL-GFP載體質(zhì)粒重組構(gòu)建和病毒包裝，用LipofectamineTM2000試劑盒將其轉(zhuǎn)染至高糖誘導(dǎo)的hRMECs中，轉(zhuǎn)染48h后，用qRT-PCR法和Western blot檢測基因沉默效率，基因沉默成功后用于后續(xù)實驗研究，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。(3)將穩(wěn)定沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的hRMECs隨機分為sh GFAP+DMSO組、sh GFAP+SRI-011381組，分別用DMSO、SRI-011381處理24h，采用Western blot檢測TGF-β信號通路相關(guān)蛋白的表達，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

1.2.3 qRT-PCR法檢測細胞中GFAP mRNA的表達收集細胞，按照RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求操作提取RNA，并快速將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書操作進行GFAP mRNA檢測。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算GFAP mRNA的相對表達量。引物信息：GFAP上游引物5’-CTGAATTCTGCTGGCTTCAAGG-3’，下游引物5’-CTAAGCTTGCTGTGCGTTGCGG-3’；GAPDH上游引物5’-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3’，下游引物5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。

1.2.4 Western blot檢測細胞中相關(guān)蛋白的表達收集細胞，用RIPA裂解液在冰上裂解30min，12000r/min離心10min，取上清轉(zhuǎn)移至EP管中，沸水煮沸10min進行變性。將上清液用5×SDS上樣緩沖液稀釋，電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，洗膜，加入一抗(鼠抗人GFAP、TGF-β1、Smad2、Smad3單克隆蛋白抗體，工作濃度1∶400～1∶1000)，4℃孵育過夜，洗膜，加二抗(山羊抗鼠辣根過氧化物酶標記的IgG抗體，1∶1000)，4℃ 2h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力收集分組處理后的細胞并調(diào)整至細胞密度為105個/mL的懸液，接種至96孔板，每孔100μL，37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24、48、72h。取出后每孔加入20μL CCK-8溶液，于酶標儀490nm波長下測吸光度值(A450)。細胞的增殖能力與吸光度值呈正比，可用于評估細胞的增殖能力。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡收集細胞，用結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞密度至106個/mL，每孔加入100μL細胞液，再加入Annexin V-/FITC(5μL)、PI(10μL)避光反應(yīng)15min，結(jié)束后，上流式細胞儀分析凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 GFAP在高糖誘導(dǎo)的hRMECs中的表達采用Western blot和qRT-PCR檢測高糖誘導(dǎo)的hRMECs中GFAP蛋白和mRNA的相對表達水平，結(jié)果顯示，與NG+hRMECs組相比，HG+hRMECs組細胞中GFAP蛋白和mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05，圖1，表1)，表明GFAP在高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中表達明顯升高。

2.2 沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的細胞模型建立采用Western blot和qRT-PCR檢測經(jīng)慢病毒介導(dǎo)沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的hRMECs中GFAP蛋白和mRNA的相對表達水平，結(jié)果顯示，與sh RNA組相比，sh GFAP組細胞中GFAP蛋白和mRNA表達水平均顯著降低(P<0.001，圖2，表2)，表明成功建立慢病毒介導(dǎo)沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞模型。

圖1 高糖誘導(dǎo)的hRMECs中GFAP蛋白的表達。

圖2 沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的細胞中GFAP蛋白的表達。

圖3 沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs凋亡的影響 A：sh RNA組；B：sh GFAP組。

表1 GFAP在高糖誘導(dǎo)的hRMECs中的表達

表2 GFAP在沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的hRMECs中的表達

2.3 沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs增殖和凋亡的影響采用CCK-8法檢測沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs增殖的影響，結(jié)果顯示，與sh RNA組相比，48、72h時，sh GFAP組細胞的增殖能力均顯著升高(P<0.001，表3)。采用流式細胞術(shù)檢測沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs凋亡的影響，結(jié)果顯示，與sh RNA組相比，sh GFAP組細胞凋亡率顯著降低(P<0.001，圖3，表3)。上述結(jié)果表明，沉默GFAP可促進高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖，抑制其凋亡。

2.4 沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs中TGF-β信號通路的影響采用Western blot檢測經(jīng)慢病毒介導(dǎo)沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的hRMECs中TGF-β信號通路相關(guān)蛋白的相對表達水平，結(jié)果顯示，與sh RNA組相比，sh GFAP組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平均顯著降低(P<0.001，圖4，表4)，表明沉默GFAP可抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中TGF-β信號通路的活性。

圖4 TGF-β信號通路相關(guān)蛋白的表達。

表3 沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs增殖和凋亡的影響

表4 TGF-β信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.5 激活TGF-β信號通路逆轉(zhuǎn)沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用Western blot檢測結(jié)果顯示，與sh GFAP+DMSO組相比，sh GFAP+SRI-011381組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 的蛋白表達量均顯著升高

圖5 激活TGF-β信號通路逆轉(zhuǎn)沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs的調(diào)控作用 A：Western blot檢測TGF-β信號通路相關(guān)蛋白的表達；B：流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

表5 激活TGF-β信號通路逆轉(zhuǎn)沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs的調(diào)控作用

(P<0.05，圖5A，表5)。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與sh GFAP+DMSO組相比，48、72h時，sh GFAP+SRI-011381組細胞增殖能力均顯著降低(P<0.05，表5)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與sh GFAP+DMSO組相比，sh GFAP+SRI-011381組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05，圖5B，表5)。上述結(jié)果表明，激活TGF-β信號通路可逆轉(zhuǎn)沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖促進及凋亡抑制作用。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變被認為是全世界失明的主要原因之一，尋找新的治療策略以防止其進展成為該領(lǐng)域科學(xué)研究的重點。GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期、后期均出現(xiàn)表達異常，其在疾病的進展中占有重要地位[10-11]。早在2007年，Zhang等[12]已報道，在高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜病變中GFAP的表達明顯升高，且?；撬峥赏ㄟ^降低高糖誘導(dǎo)的GFAP上調(diào)而發(fā)揮減緩大鼠早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用。近期，Bahr等[13]在糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究中也報道，GFAP的表達水平異常升高，且度洛西汀可通過下調(diào)GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮治療作用。但是GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能及機制仍有待探索。本研究在體外建立了高糖誘導(dǎo)的hRMECs細胞模型，通過qRT-PCR和Western blot檢測了其中GFAP的表達，結(jié)果顯示，GFAP的表達水平明顯升高。進一步研究中，通過慢病毒介導(dǎo)GFAP基因穩(wěn)定沉默的高糖誘導(dǎo)的hRMECs細胞模型，為深入研究GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能奠定基礎(chǔ)，也為本課題組后續(xù)的實驗研究進行鋪墊。本研究通過CCK-8法、流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖和凋亡發(fā)現(xiàn)，沉默GFAP的高糖誘導(dǎo)的hRMECs細胞增殖明顯上調(diào)，細胞凋亡明顯下調(diào)，該結(jié)果揭示了GFAP沉默在高糖誘導(dǎo)的hRMECs細胞中的增殖促進和凋亡抑制作用，提示GFAP抑制劑在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的治療價值，為GFAP生物制劑的開發(fā)提供參考。不足的是，本研究結(jié)果并未在動物體內(nèi)進行驗證。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，沉默GFAP后，TGF-β信號通路關(guān)鍵基因TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達水平均明顯降低，揭示了沉默GFAP可抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs中TGF-β信號通路的活性，推測TGF-β信號通路可能與GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能相關(guān)。

TGF-β信號通路的異常在人類的多數(shù)疾病中均可表現(xiàn)，包括心血管疾病、免疫疾病和胚胎發(fā)育異常、腫瘤等[14]。Lou等[15]在糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究中發(fā)現(xiàn)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型中TGF-β信號通路關(guān)鍵基因TGF-β1、p-Smad3的表達均顯著升高，即TGF-β信號通路活性異常升高。Li等[16]研究也報道，上調(diào)TGF-β1信號通路的活性可作為長鏈非編碼RNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄物(LncRNA-MIAT)抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖的作用機制。雖然，GFAP在神經(jīng)損傷、腦缺血-再灌注損傷和膠質(zhì)瘤中均通過調(diào)控TGF-β信號通路發(fā)揮作用[17-18]，但是在糖尿病視網(wǎng)膜病變中該通路是否會發(fā)揮同樣的功能有待驗證。本研究檢測了激活TGF-β信號通路后慢病毒介導(dǎo)沉默GFAP基因的高糖誘導(dǎo)的hRMECs的增殖和凋亡情況發(fā)現(xiàn)，激活TGF-β信號通路逆轉(zhuǎn)了沉默GFAP對高糖誘導(dǎo)的hRMECs的增殖促進、凋亡抑制作用，提示在高糖誘導(dǎo)的hRMECs中不僅GFAP可正向調(diào)控TGF-β信號通路的活性，相反，TGF-β信號通路的活性也可以逆向反作用于GFAP在高糖誘導(dǎo)的hRMECs中的表達和功能。上述研究結(jié)果為GFAP在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的生物價值開發(fā)提供了理論參考。

綜上所述，沉默GFAP可促進高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的增殖并抑制凋亡，發(fā)揮保護作用，其作用機制與調(diào)控TGF-β信號通路的活性相關(guān)，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供了新的理論參考。