張欣磊，邱雅靜，王艷紅，*，宋垚彬，吳愛(ài)平，蘇秀

1. 浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300

2. 杭州師范大學(xué)生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與恢復(fù)杭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310036

3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128

0 前言

土壤鹽堿化是世界性的的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題之一[1-4]。我國(guó)鹽漬土總面積約 1×108hm2，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江沿岸和北方地區(qū)，且受人口持續(xù)增長(zhǎng)、工業(yè)污染突出、灌溉農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展和化肥大量使用等因素的影響，目前土壤次生鹽堿化不斷擴(kuò)展[5]。研究表明，土壤鹽漬化極大地抑制了植物根、莖、葉等器官的生長(zhǎng)和發(fā)育[6-7]，導(dǎo)致植物受到損傷甚至死亡從而造成農(nóng)林業(yè)嚴(yán)重減產(chǎn)[8-9]。綜合已有的研究，鹽害對(duì)植物的影響主要體現(xiàn)在三個(gè)方面: ①降低土壤溶液的滲透勢(shì)，減少植物根系對(duì)水分的吸收，從而使植物遭受“生理干旱”[3，10]；②過(guò)量的 Na+和 Cl-對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，例如，破壞了酶和其他大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、使細(xì)胞器和質(zhì)膜受損，從而使光合作用、呼吸作用和蛋白質(zhì)合成等主要的代謝過(guò)程受阻[10-11]；③植物養(yǎng)分失衡，這是由于離子的選擇性吸收導(dǎo)致植物生長(zhǎng)必須的養(yǎng)分(如N和P等)和離子的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)受阻[3，12]。為降低土壤鹽度和減少農(nóng)林業(yè)損失，研究者們嘗試從物理、化學(xué)和工程等不同角度來(lái)改良鹽漬土和選育抗鹽或耐鹽的植物品種或通過(guò)基因工程改造的方法來(lái)培育新的抗鹽品種[13]。然而，這些方法在實(shí)施過(guò)程中，要么容易受到氣候、水分條件的嚴(yán)重限制而易造成土壤反鹽，要么歷時(shí)長(zhǎng)且投資巨大[3]。通過(guò)生物的方法，即應(yīng)用 AM 真菌(叢枝菌根真菌——Abuscular mycorrhizal fungi，簡(jiǎn)稱 AM 真菌)來(lái)降低鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)的抑制作用被認(rèn)為是最為綠色高效的方法，近些年越來(lái)越受到人們重視[12，14-19]。AM真菌是土壤中分布最為廣泛的根際微生物類群，與農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)關(guān)系最為密切，能與陸地上 80%以上的植物根系建立共生關(guān)系，形成菌根結(jié)構(gòu)[15]。國(guó)內(nèi)外研究表明，AM 真菌在鹽生環(huán)境中天然存在，且以球囊霉屬(Glomus)為主要優(yōu)勢(shì)屬，有利于提高植物的耐鹽性，促進(jìn)植物在鹽漬條件下的生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收[3，12]。然而，關(guān)于AM真菌對(duì)鹽脅迫下白芨生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收的影響研究則相對(duì)較少。

白芨[Bletilla striata(Thunb.) Reichb. f.]是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，其地下塊根具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌等功效，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[20]。目前對(duì)白芨的研究比較有限，主要集中在種質(zhì)資源、種苗繁育、化學(xué)成分分析等方面[21-22]。浙江省具有較大面積的沿海灘涂，如何擴(kuò)大白芨在鹽脅迫生境下的生長(zhǎng)是其產(chǎn)業(yè)鏈上一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)接種 AM 真菌，研究鹽脅迫下AM真菌對(duì)白芨生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理，以期為白芨的大面積栽培和產(chǎn)業(yè)化管理提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本實(shí)驗(yàn)在浙江省杭州臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)平山實(shí)驗(yàn)基地(119°43′E，30°15′N)進(jìn)行。臨安位于浙江省西北部，為亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為 16.4 ?C，極端最高氣溫為 41.9 ?C，極端最低氣溫為-9.2?C，全年日照時(shí)數(shù)為 1847.3 h，年平均降水量為 1628.6 mm，無(wú)霜期為 237 d，土壤為紅黃壤[23]。

1.2 供試材料

白芨(B. striata)屬多年生草本地生蘭科(Orchidaceae)白芨屬(BletillaRchb. F)植物，主要分布在貴州、廣西、安徽、四川、云南、陜西、甘肅等地，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性、觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[22]。本實(shí)驗(yàn)選用健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌培養(yǎng)的1年生白芨幼苗20株作為實(shí)驗(yàn)材料。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，所有白芨幼苗移栽于 18 cm × 11 cm × 10 cm帶有盆托的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為當(dāng)?shù)丶t黃壤和進(jìn)口泥炭土按3:1體積比混合均勻后過(guò)2 mm土壤篩，121?C高壓濕熱滅菌2 h，以消除基質(zhì)中的真菌孢子和其他土壤微生物，并放置兩周后使用。每盆裝混合基質(zhì) 750 g。培養(yǎng)基質(zhì)養(yǎng)分含量為: 有機(jī)質(zhì)21.94 mg·g-1，全氮 0.80 mg·g-1，全磷 0.32 mg·g-1，pH 5.68(水:土 =5:1)。供試菌種為摩西球囊霉(Glomus mosseae；BGC HUN03B)，由北京市農(nóng)林科學(xué)研究院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理

采用二因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置NaCl鹽溶液處理(0 mM和200 mM)兩個(gè)水平和AM真菌接種處理(不接種和接種摩西球囊霉)兩個(gè)水平，共計(jì)四個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合重復(fù)5次，隨機(jī)排列。其中，AM 真菌接種處理中接種物為經(jīng)高粱擴(kuò)繁后制成含有孢子、菌絲及侵染根段的接種物，其用量為每盆 20 g；不接種處理中每盆施加等量的滅菌接種物和不滅菌接種物水濾液100 mL，以保證不同處理間除AM真菌以外的微生物區(qū)系保持一致[24]。幼苗生長(zhǎng)30 d后開(kāi)始鹽脅迫處理，為避免鹽溶液一次性加入對(duì)植物造成傷害，將鹽溶液分7次加入土壤中，每天每盆添加相應(yīng)濃度鹽溶液50 mL，連續(xù)添加7 d，這樣7 d后每盆添加的鹽溶液總量為350 mL，對(duì)照加等量的蒸餾水[25]。常規(guī)管理，適時(shí)澆水，每次澆水時(shí)掌握適量，盡量減少溢出，溢出的鹽溶液要重新倒回花盆內(nèi)，以保證實(shí)驗(yàn)期間各處理鹽濃度的一致性。實(shí)驗(yàn)期間，塑料大棚內(nèi)平均溫度為 28.6 ?C，平均濕度為65%。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間為2016年5月初至2016年10月底。收獲時(shí)將各處理組植株用蒸餾水洗凈，吸干表面水分，測(cè)定根長(zhǎng)、基徑，并將植株分為根、莖和葉不同部分，測(cè)量其鮮重。隨機(jī)選取部分新鮮葉片，測(cè)其葉面積。葉面積的測(cè)定采用掃描儀(Epson V330，Japan)分別將各個(gè)葉片掃描成電子圖像后，應(yīng)用Image-J 軟件(1.44p；National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)測(cè)其面積[5]。同時(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)選取若干根樣，利用Phillips和Hayman[26]改進(jìn)的方法染色，采用網(wǎng)格交叉法測(cè)定侵染率[27]。最后，將白芨其他部分和剩余根系放入65 ?C下烘至恒重并稱其各部分干重。并測(cè)量植物地上、地下兩部分的全N和全P含量。植物營(yíng)養(yǎng)元素N用H2SO4-H2O2凱氏定氮法測(cè)定，全P含量用釩鉬黃吸光光度法測(cè)定[28]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以白芨的菌根生長(zhǎng)效應(yīng)(MGR)[29]、地下部分(白芨的藥用成分在于其地下部分)磷依賴性(MPR)、氮依賴性(MNR)[4]來(lái)量化不同鹽處理水平下菌根效應(yīng)，其計(jì)算公式如下所示:

對(duì)所測(cè)指標(biāo)采用二元方差分析(General Linear Model；GLM 過(guò)程，SPSS 23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)研究鹽脅迫和AM真菌對(duì)白芨各相關(guān)指標(biāo)的影響。數(shù)據(jù)分析前，根長(zhǎng)、葉面積和根干重經(jīng)平方根轉(zhuǎn)換，基徑和根冠比經(jīng) lg10轉(zhuǎn)換后符合齊性檢驗(yàn)，其他指標(biāo)不經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換均符合正態(tài)性和齊性檢驗(yàn)。同時(shí)，采用LSD法檢驗(yàn)各個(gè)處理組合之間的差異顯著性。另外，采用獨(dú)立性 t檢驗(yàn)(SPSS 23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析鹽脅迫不同水平對(duì)白芨菌根MGR、MPR和MNR的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌對(duì)鹽脅迫下白芨根系侵染率的影響

通過(guò)對(duì)白芨根系菌根侵染率的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫、AM真菌及其兩者交互作用均對(duì)白芨根系侵染率具有顯著或極顯著的影響(表1)。與對(duì)照鹽濃度相比，高鹽濃度下，AM真菌接種植株(簡(jiǎn)稱AM植株；下同)的根系侵染率顯著下降了約 44.1%，說(shuō)明高鹽脅迫對(duì) AM真菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用；不論是在對(duì)照或高鹽條件下，與未接種AM真菌的植株(簡(jiǎn)稱 NM 植株；下同)(平均侵染率為4.11%)相比，AM 植株的根系侵染率均顯著提高(圖 1)。

2.2 AM真菌對(duì)鹽脅迫下白芨生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收的影響

通過(guò)二元方差分析表明，鹽脅迫對(duì)白芨的根長(zhǎng)、基徑、根干重和總干重均具有顯著或極顯著的影響；AM真菌根干重和總干重具有顯著影響；兩者的交互僅對(duì)總干重有顯著影響(表 1)。進(jìn)一步地，通過(guò)對(duì)總干重的分析發(fā)現(xiàn)，接種 AM真菌顯著提高了白芨的總干重，尤其是在對(duì)照鹽濃度下，與 NM 植株相比，AM 植株的總干重顯著增加了約 56.1%；然而，隨著鹽濃度增加，白芨總干重下降，在高鹽濃度下，AM 植株的總干重雖然高于NM植株，但兩者差異并不顯著，說(shuō)明 AM真菌的促進(jìn)作用受到鹽脅迫的抑制(圖 2A)。鹽處理及其 AM真菌處理對(duì)白芨根冠比的作用并不明顯，說(shuō)明其對(duì)白芨的生物量分配沒(méi)有明顯作用(圖2B)。

表1 白芨幼苗的相應(yīng)參數(shù)對(duì)鹽脅迫、AM真菌及其兩者交互效應(yīng)的二元方差分析的F值及其自由度Table 1 F values of Two-way ANOVA for the effects of salt stress, arbuscular mycorrhizal fungi and their interactive effects on the parameters of Bletilla striata seedlings

圖1 鹽脅迫下AM真菌對(duì)白芨幼苗根系侵染率的影響Figure 1 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)on root colonization of Bletilla striata under salt stress

圖2 鹽脅迫下AM真菌對(duì)白芨幼苗總干重(A)和根冠比(B)的影響Figure 2 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)on total dry weight (A) and root /shoot ratio (B) of Bletilla striata under salt stress

通過(guò)對(duì)地上和地下部分氮磷含量的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對(duì)地上和地下部分的氮磷含量均有極顯著的影響；AM 真菌對(duì)地上部分氮含量和地下部分氮含量有顯著或極顯著的影響；兩者的交互作用對(duì)地上部分磷含量和地下部分的氮磷含量均有顯著或極顯著的影響(表 1)。隨著鹽濃度增加，白芨地上部分的氮含量顯著增加；另外，在對(duì)照鹽濃度和高鹽濃度下AM植株的地上部分氮含量比NM植株分別顯著增加了約10.8%和12.1%(圖3A)。類似地，隨著鹽濃度增加，地下部分的氮含量顯著增加；在對(duì)照鹽濃度下，AM植株與NM植株的地下部分氮含量沒(méi)有顯著差異而在高鹽濃度下，AM植株的地下部分氮含量比NM植株顯著降低了約9.8%(圖3B)。隨著鹽濃度增加，地上部分磷含量顯著下降；對(duì)照鹽濃度下，AM 植株的地上部分磷含量比NM植株顯著增加了約8%而在高鹽濃度下，AM植株的地上部分磷含量與NM植株差異不顯著，說(shuō)明在高鹽下AM真菌對(duì)地上部分磷含量的促進(jìn)作用受到抑制(圖3C)。隨著鹽濃度增加，白芨地下部分磷含量顯著增加，尤其AM植株的地下部分磷含量在高鹽下比在對(duì)照鹽濃度下顯著增加了約20%；在對(duì)照鹽濃度下，AM 植株的地下部分磷含量比NM植株顯著降低了約10%而在高鹽濃度下，AM植株則比NM植株顯著增加了約11%(圖3D)。

進(jìn)一步地，通過(guò)對(duì)白芨總干重與各測(cè)量指標(biāo)的相關(guān)回歸分析發(fā)現(xiàn)，白芨總干重與地上部分磷含量顯著負(fù)相關(guān)而與地下部分氮含量顯著正相關(guān)(圖4)。此外，通過(guò)對(duì) AM 菌根效應(yīng)的分析發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，白芨的菌根生長(zhǎng)效應(yīng)(MGR)雖然下降但鹽處理的效應(yīng)并不顯著(t4= 1.966，P= 0.121)；白芨的氮依賴性(MNR)顯著下降了約8倍多(t4= 3.708，P= 0.021)而磷依賴性(MPR)則顯著上升了約2倍多(t4= 14.119，P= 0.000) (圖 5)。

圖3 鹽脅迫下AM真菌對(duì)白芨幼苗地上部分氮含量(A)、地下部分氮含量(B)、地上部分磷含量(C)和地下部分磷含量(D)的影響Figure 3 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on N concentration of shoot (A), N concentration of root (B), P concentration of shoot (C) and P concentration of root (D) of Bletilla striata under salt stress

圖4 鹽脅迫和AM真菌作用下白芨幼苗總干重與地上部分磷含量(A)和地下部分氮含量(B)的關(guān)系Figure 4 Relationship between total dry weight and P concentration of shoot (A) and N concentration of root (B) of Bletilla striata under salt stress and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)

圖5 不同鹽脅迫水平下接種AM真菌對(duì)白芨幼苗菌根效應(yīng)的影響Figure 5 Effects of AMF on the mycorrhizal growth response (MGR), mycorrhizal P response (MPR) and mycorrhizal N response (MNR) of Bletilla striata under salt stress

3 討論

3.1 AM真菌對(duì)鹽脅迫下白芨生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收的影響

本實(shí)驗(yàn)中鹽處理對(duì)白芨的侵染率和總干重生長(zhǎng)具有顯著的負(fù)效應(yīng)(圖1和圖2)，這與以往鹽處理對(duì)胡椒(Capsicum annuumL.)[30]，羊草(Leymus chinensis)[4]，西紅柿等[31]的研究是相符的，其原因可能是植物需要消耗一定的能量來(lái)抵消鹽脅迫的影響[25]。許多學(xué)者認(rèn)為鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)在于Na+/Cl-離子毒害產(chǎn)生的直接效應(yīng)和鹽離子引起土壤/植物的滲透脅迫而導(dǎo)致的間接效應(yīng)共同作用的結(jié)果[32-33]。另外，本實(shí)驗(yàn)中，接種 AM 真菌顯著提高了白芨的總干重，AM真菌對(duì)白芨生物量的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在生物量積累上，對(duì)根冠比即生物量的分配并沒(méi)有顯著影響，這與以往的研究并不相符[4，34]。接種AM真菌對(duì)白芨養(yǎng)分吸收的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在各個(gè)鹽處理下的地上部分N含量和高鹽脅迫下的地下部分P含量(見(jiàn)圖3)。AM真菌對(duì)植物生長(zhǎng)的增強(qiáng)效應(yīng)究其原因，大多學(xué)者認(rèn)為是由于菌根增強(qiáng)了礦質(zhì)養(yǎng)分特別是難移動(dòng)的 P元素的吸收[33，35]，據(jù)估計(jì)，植物吸收的P元素有將近80%是由AM真菌的根外菌絲提供的，這可能是由于與非菌根植物相比，AM 真菌的菌絲網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)大了根系在土壤中的吸收范圍[36]，但也有研究認(rèn)為 AM 真菌的效應(yīng)在于其提高了植株K元素的含量[29]。而本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照鹽濃度下，AM真菌對(duì)白芨總干重的促進(jìn)作用很大程度上應(yīng)得益于菌根對(duì)地下部分N元素吸收的促進(jìn)作用，這與吳建新等人[37]對(duì)草莓的研究是相符的。已有研究表明，N元素吸收的提高有利于減少Na離子的毒害作用從而間接地有利于維持植物葉綠素含量[38]。

3.2 鹽脅迫下AM真菌對(duì)白芨的菌根效應(yīng)

值得注意的是，AM真菌對(duì)白芨生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要是在對(duì)照鹽處理下，在高鹽濃度下(200 mM NaCl)其促進(jìn)效應(yīng)減弱(見(jiàn)圖2)。顯然，當(dāng)環(huán)境脅迫強(qiáng)度加大時(shí)，不僅植物生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)還阻礙了AM 真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，進(jìn)而侵染率下降，這與本實(shí)驗(yàn)中高鹽濃度下侵染率的顯著降低是相符的[11]。侵染率的高低是AM真菌功能發(fā)揮的基礎(chǔ)[39]。已有研究表明，隨著鹽脅迫的加劇，AM真菌對(duì)植物耐鹽性的促進(jìn)作用將會(huì)降低，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏交螂p方受抑制[40-41]。我們的研究表明，隨著鹽脅迫濃度的增加，白芨的菌根生長(zhǎng)效應(yīng)(MGR)降低，這與張義飛[4]的研究并不相符，說(shuō)明高鹽脅迫對(duì) AM 真菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制效應(yīng)，AM真菌的存在對(duì)其生長(zhǎng)是不利的，這可能是因?yàn)樵诰采w系中，AM真菌雖然可以促進(jìn)宿主植物養(yǎng)分的吸收，但同時(shí)AM真菌要消耗宿主植物固定的高達(dá)20%的碳物質(zhì)，因此，在脅迫環(huán)境下，宿主植物的碳損耗大于其養(yǎng)分吸收的收益，從而導(dǎo)致菌根生長(zhǎng)效應(yīng)下降[15]。事實(shí)上，在逆境條件下，AM和植物共生體可能面臨著各種各樣影響其互利共生關(guān)系的生物和非生物因素，其綜合作用可能會(huì)加速或削弱AM真菌對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[11]。與此同時(shí)，白芨對(duì)N元素的依賴性(MNR)下降而對(duì) P元素的依賴性(MPR)升高，說(shuō)明隨著鹽濃度升高，白芨對(duì)N元素的依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)P元素的依賴性，而以往對(duì)羊草的研究則發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度升高，植物對(duì)P的依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)K的依賴性[4]。在今后的研究中有必要從多個(gè)角度開(kāi)展鹽脅迫下接種 AM 真菌植株的響應(yīng)格局研究，以便全面深入揭示其響應(yīng)機(jī)理。

以上研究結(jié)果表明，鹽脅迫顯著降低了白芨根系侵染率、總干重和地上部分P含量；接種AM真菌則顯著提高了白芨根系侵染率、總干重、地上部分N含量及地下部分P含量，說(shuō)明接種AM真菌對(duì)白芨的抗鹽性具有一定的提高作用。尤其是，在高鹽脅迫下，接種 AM 真菌顯著提高了白芨地上部分N含量和地下部分 P含量，我國(guó)南方亞熱帶多為貧瘠的酸性紅壤[42]，這對(duì)于提高白芨產(chǎn)量及促進(jìn)白芨對(duì)礦物養(yǎng)分的吸收無(wú)疑是非常有利的，可嘗試在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中加以推廣應(yīng)用。然而，由于本實(shí)驗(yàn)鹽處理水平的限制，無(wú)法獲知確切的 AM 真菌可應(yīng)用的鹽脅迫濃度范圍，在今后的深入研究中有待于設(shè)置多個(gè)鹽處理水平梯度并從多個(gè)層面揭示AM真菌對(duì)白芨生理生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理。