楊琪琪，董建斌，王蘭霞，朱旭江，李士博

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000；2.蘭州和盛堂制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000)

潔白膠囊為藏族驗(yàn)方，是2015版《中國(guó)藥典》一部中收載的“潔白丸”的改進(jìn)劑型，處方中包含14味藥材，除五靈脂膏外，訶子等十三味藥材均以原粉入藥[1]。在生產(chǎn)過程中，以藥材原粉入藥的中藥制劑要求控制微生物水平[2]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，市售潔白膠囊和進(jìn)入生產(chǎn)車間滅菌前的潔白膠囊原粉的HPLC圖譜有較大差異，主要表現(xiàn)在圖譜中某些色譜峰的升高或降低。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3-8]發(fā)現(xiàn)，潔白膠囊處方中藥材多含揮發(fā)性成分，實(shí)驗(yàn)組推測(cè)可能是在滅菌過程中由于滅菌溫度控制不當(dāng)，造成藥品中某些成分的損失。為進(jìn)一步較好地控制生產(chǎn)過程，細(xì)化工藝參數(shù)，課題組提出“中藥制劑生產(chǎn)過程中微生物質(zhì)量管理和質(zhì)量保證”的研究?jī)?nèi)容，嘗試優(yōu)化潔白膠囊等含揮發(fā)性成分的中藥制劑生產(chǎn)過程中的低溫滅菌工藝，既能保證微生物限度合格，也能使產(chǎn)品質(zhì)量有所保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：HITACHI Chromaster(日本日立)；色譜柱：資生堂CAPCELL PAK MG C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器，KQ-500DE)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，GZX-9146MBE)；十萬分之一電子天平(MS205DU)、萬分之一電子天平(ME204)均購(gòu)自瑞士梅特勒公司。

1.2 試藥

對(duì)照品：沒食子酸(110831-200803，90.1%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，鞣花酸(72340010，99.9%)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磷酸(分析純)；實(shí)驗(yàn)水(超純水)；乙腈(進(jìn)口色譜純)。潔白膠囊原粉由甘肅某藥企提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 滅菌工藝

參考2015年版《中國(guó)藥典》，若藥品中的相關(guān)物質(zhì)對(duì)熱不敏感，可首選過度殺滅法進(jìn)行滅菌，若藥品中相關(guān)物質(zhì)對(duì)熱敏感，其滅菌方法的選擇取決于在一定的時(shí)間內(nèi)，一定的生產(chǎn)批次的被滅菌物品微生物污染的水平及其耐熱性[9]，且結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，一般藥物滅菌時(shí)溫度不高于80 ℃為宜[10]，實(shí)驗(yàn)組選定6個(gè)滅菌工藝(見表1)，經(jīng)過滅菌后，比較6種滅菌工藝的微生物水平。

表1 潔白膠囊滅菌工藝

將混合均勻的潔白膠囊原粉稱取約50 g，每個(gè)編號(hào)2份平行樣品，共12份樣品(1份做微生物水平實(shí)驗(yàn)，1份做HPLC圖譜實(shí)驗(yàn))，裝入清洗干凈滅過菌(防止外源性污染造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不可靠)的玻璃容器中，按表1編號(hào)對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行編號(hào)，準(zhǔn)備工作完成后，將準(zhǔn)備好的樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中按上述滅菌條件對(duì)樣品進(jìn)行滅菌，比較微生物水平，結(jié)果見表2。

表2 不同滅菌工藝微生物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，6種滅菌工藝均符合2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度的要求，因此，對(duì)熱敏感成分的中藥制劑可采用低溫滅菌，但具體采用哪一種滅菌工藝，還需要進(jìn)行HPLC圖譜的比較，滅菌前后無明顯變化則為最佳滅菌工藝。

2.2 HPLC圖譜

2.2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂CAPCELL PAK MG C18色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫(見表3)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃。

表3 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液配制 采用稱量盤精密稱取鞣花酸16.53 mg，用80%甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液Ⅰ；另同法稱取沒食子酸對(duì)照品21.35 mg，用80%甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液Ⅱ；從儲(chǔ)備液Ⅰ中精密量取8 mL，儲(chǔ)備液Ⅱ中精密量取1 mL，定容至10 mL容量瓶中，即得濃度分別為0.264 215 52 mg/mL的鞣花酸和0.076 945 4 mg/mL的沒食子酸混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 樣品溶液制備 精密稱定6個(gè)編號(hào)潔白膠囊原粉0.2 g(見表4)，置于錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，稱重后超聲處理30 min，冷卻后用甲醇補(bǔ)足失重，混合均勻后靜置，取續(xù)濾液，即得。

表4 潔白膠囊不同滅菌工藝的取樣量

2.2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取上述兩種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以鞣花酸色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其他各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見圖1和表5、表6。

圖1 HPLC色譜

由圖1、表5、表6可以看出，樣品在滅菌前后色譜峰的個(gè)數(shù)并未增加或減少，只是原有色譜峰的相對(duì)峰面積發(fā)生變化，表6所示，滅菌工藝2和5兩者相對(duì)峰面積更接近于滅菌前的相對(duì)峰面積，考慮到節(jié)約成本等實(shí)際生產(chǎn)情況，選擇滅菌工藝2(滅菌溫度60 ℃，滅菌時(shí)間12 h)為最佳滅菌工藝。

2.2.5 方法學(xué)考察 (1)專屬性考察。取滅菌工藝2的供試品溶液10 μL、混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜，結(jié)果見圖1。通過專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該分析方法能正確檢測(cè)所指認(rèn)的特征峰，該方法可行。

(2)精密度考察。取滅菌工藝2的潔白膠囊原粉約0.2 g，精密稱定，按照“2.2.3”項(xiàng)下處理，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，以鞣花酸色譜峰為參照峰，計(jì)算峰1～峰11的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7和表8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在精密度考察中，連續(xù)6次進(jìn)樣的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.001%～0.002%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD在0.001%～0.022%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

(3)重復(fù)性考察。取滅菌工藝2的潔白膠囊原粉，約0.2 g，平行6份，精密稱定，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，以8號(hào)峰鞣花酸色譜峰為參照峰，計(jì)算峰1～峰11的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9和表10。

表5 滅菌前后相對(duì)保留時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)比

表6 滅菌前后相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)對(duì)比

表7 潔白膠囊樣品精密度考察結(jié)果(相對(duì)保留時(shí)間)

表8 潔白膠囊樣品精密度考察結(jié)果(相對(duì)峰面積)

表9 潔白膠囊樣品相對(duì)保留時(shí)間重復(fù)性考察結(jié)果

表10 潔白膠囊樣品相對(duì)峰面積重復(fù)性考察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6份供試品溶液中11個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.001%之內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD在0.002%～0.042%范圍內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

(4)穩(wěn)定性考察。取滅菌工藝2的潔白膠囊原粉，取約0.2g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下處理，分別在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，以8號(hào)峰鞣花酸色譜峰為參照峰，計(jì)算峰1～峰11的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表11和表12。

表11 潔白膠囊樣品相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定性考察結(jié)果 (min)

表12 潔白膠囊樣品相對(duì)峰面積穩(wěn)定性考察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)11個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.001%～0.002%之內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD在0.003%～0.114%范圍內(nèi)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

微生物滅菌過程中，樣品材料需粉碎成粗粉，過二號(hào)篩，以保證樣品的均一性，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中為了確保樣品在滅菌結(jié)束后不受外源性污染物的影響，本研究采用阻止微生物通過的橡膠塞，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠。相關(guān)文獻(xiàn)[11]提到，滅菌要求須使F0≥8，對(duì)于含揮發(fā)性成分的中藥制劑，可使F0=8，因受實(shí)驗(yàn)條件限制，未能對(duì)滅菌工藝進(jìn)行更細(xì)化的研究，期望在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中完善這一環(huán)節(jié)。

經(jīng)計(jì)算，滅菌溫度60 ℃，滅菌時(shí)間12 h時(shí)，滅菌前后沒食子酸和鞣花酸含量基本不發(fā)生變化，其他滅菌條件下微生物限度雖然也達(dá)標(biāo)，但二者含量與滅菌前相差較大，故不作為最佳滅菌條件考慮。同時(shí)HPLC圖譜實(shí)驗(yàn)過程中，還對(duì)樣品的提取方式(如提取溶劑、提取時(shí)間等)和耐用性(如不同柱溫、不同流速等)進(jìn)行了相應(yīng)的考察，考察結(jié)果顯示提取溶劑為甲醇，超聲處理30 min時(shí)樣品峰形較好，且在一定的范圍內(nèi)，不同柱溫、不同流速對(duì)樣品峰形峰面積并無太大影響，說明該方法耐用性好，可作為HPLC圖譜過程控制方法。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，6種不同的滅菌工藝對(duì)潔白膠囊原粉的產(chǎn)品質(zhì)量有不同程度的影響，考慮到實(shí)際生產(chǎn)，選取滅菌工藝2(滅菌溫度60 ℃，滅菌時(shí)間12 h)為最佳滅菌工藝，既能保證微生物限度合格，又能控制潔白膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量。

以原粉入藥的中藥制劑在生產(chǎn)過程中都存在微生物控制這一環(huán)節(jié)，本試驗(yàn)研究了潔白膠囊的滅菌工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，課題組也對(duì)大蜜丸做過類似的比較研究，發(fā)現(xiàn)滅菌工藝與制劑類型有一定的相關(guān)性，限于時(shí)間因素，并未對(duì)劑型和滅菌工藝的相關(guān)性做進(jìn)一步研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)以此為出發(fā)點(diǎn)，選取同一種劑型的多種中成藥進(jìn)行詳細(xì)研究，從特殊中找到一般規(guī)律，為企業(yè)生產(chǎn)過程中微生物的控制提供技術(shù)指導(dǎo)。