路 帥，郭建利，彪雅寧，張一昕，3，石 鋮，劉 晨，韓 雪，3*

(1.石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，河北 石家莊 050599；2.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；3.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050091)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以廣泛性肝細(xì)胞呈現(xiàn)較大空泡性脂肪變性和脂肪大量蓄積為主要表現(xiàn)，且無過量飲酒史的代謝性疾病[1-2]。由于生活水平提高，不良飲食習(xí)慣，日益增加的工作壓力，網(wǎng)絡(luò)信息環(huán)境的沖擊等，NAFLD發(fā)病率逐年升高[3]，患者出現(xiàn)內(nèi)皮功能失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化[4-5]。

中醫(yī)基本理論將非酒精性脂肪肝歸屬于“痰濁”“血瘀”“癥瘕”“積聚”等范疇。本研究認(rèn)為，痰濕、瘀血為NAFLD主要病理基礎(chǔ)，以活血消痰為根本治法。丹參功效為活血祛瘀、涼血消癰、養(yǎng)血安神，丹參所含脂溶性成分如丹參酮能改善血液循環(huán)、抗菌消炎，水溶性成分具有抗氧化、抗凝血、抗血栓、調(diào)節(jié)血脂等作用[6]。澤瀉能夠利水濕、消痰濁，以萜類為主要化學(xué)成分，具有降血糖、抗血栓和抑制斑塊等作用[7]。本課題主要探究丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉對NAFLD大鼠的保護(hù)作用是否與改善氧化應(yīng)激水平和血管內(nèi)皮功能有關(guān)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量：(200±20)g，購于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號：1603048)。

1.2 藥物

丹參、澤瀉購于河北省石家莊市樂仁堂藥店，水煎至所需濃度；東寶甘泰片購于通化東寶藥業(yè)股份有限公司(批號：151204)。

1.3 試劑

游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒購于北京中生生物工程技術(shù)公司(批號分別為201611、201615、201605、201609、201602)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號：201611、201605)；內(nèi)皮素(ET-1)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、血栓烷B2(TXB2)放射免疫試劑盒購于北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司(批號分別為201601、201612、201615)。

2 方法

2.1 分組

60只大鼠隨機(jī)分為6組：正常組(C)、模型對照組(M)、丹參水煎劑組(S，5 g·kg-1)、澤瀉水煎劑組(R，3.33 g·kg-1)、丹澤水煎劑組(SR，8.33 g·kg-1)、陽性藥(東寶甘泰)對照組(D，1.25 g·kg-1)，每組10只。

2.2 造模

正常組喂飼普通飼料，其余各組均給予高脂飼料[8](配方：1.5%膽固醇+0.5%膽鹽+10%豬油+88%基礎(chǔ)飼料)，連續(xù)9周。

2.3 給藥

從造模第1天開始，正常組和模型對照組灌服蒸餾水，丹參水煎劑組、澤瀉水煎劑組、丹澤水煎劑組、東寶甘泰組灌服相應(yīng)藥物，每日1次，用藥體積為1 mL/100 g，連續(xù)8周。

2.4 取材

8周末，4%烏拉坦麻醉，股動(dòng)脈取血，分離血清待檢，同時(shí)迅速剖取適宜大小的肝組織于4%多聚甲醛液中固定。

2.5 指標(biāo)檢測

酶法測定血清TC、TG、FFA含量；賴氏法測定 AST、ALT的活性；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色分析法；放射免疫分析法測定大鼠血漿ET-1、6-Keto-PGF1α和TXB2含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血清TC、TG、FFA含量的影響

NAFLD大鼠血清TC、TG、FFA的含量較正常組明顯升高(P<0.01)，證明造模成功，丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血清TC、TG、FFA的含量較模型組均明顯降低(P<0.01)。其中，丹澤組TC含量明顯低于丹參組和澤瀉組(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清TC、TG、FFA的含量

3.2 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血清ALT和AST活性的影響

NAFLD大鼠血清ALT、AST的活性較正常組明顯升高(P<0.01)，丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血清ALT、AST的活性較模型組均明顯降低(P<0.01)。其中，丹參組、澤瀉組及丹澤組血清ALT的活性均低于東寶甘泰對照組(P<0.01或P<0.05)，丹澤組ALT活性明顯低于丹參組和澤瀉組(P<0.01)；丹澤組AST活性低于對照組(P<0.05)，丹澤組AST活性明顯低于丹參組(P<0.01)。見表 2。

表2 各組大鼠ALT和AST的活性

3.3 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血清SOD和MDA活性或含量的影響

NAFLD大鼠SOD的活性較正常組明顯降低，MDA的含量較正常組明顯升高(P<0.01)，丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組SOD的活性均明顯升高(P<0.01)，MDA的含量明顯降低(P<0.01)。丹參和澤瀉組血清SOD的活性均低于東寶甘泰對照組(P<0.01)；丹澤組在升高SOD的活性、降低MDA含量方面的作用明顯優(yōu)于丹參組和澤瀉組(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠SOD和MDA的活性或含量

3.4 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

結(jié)果顯示(如圖1所示)：正常組大鼠肝細(xì)胞為多邊形，排列呈放射狀，較為整齊，無腫脹及脂肪變性。模型組大鼠肝細(xì)胞顯現(xiàn)中度水腫，發(fā)生明顯的脂肪變性，部分肝細(xì)胞中脂滴融合成大的脂肪空泡。各給藥組肝細(xì)胞脂肪變性程度均有所減輕。

注：A.正常組；B.模型組；C.東寶甘泰組；D.丹參組；E.澤瀉組；F.丹澤組。

3.5 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血漿ET、6-Keto-PGF1α和TXB2含量的變化

NAFLD大鼠血漿ET含量較正常組明顯升高(P<0.01)。丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血漿ET含量較模型組明顯降低(P<0.01)。其中，丹參組、澤瀉組和丹澤組的血漿ET含量均低于東寶甘泰對照組(P<0.01或P<0.05)，而丹澤組血漿ET含量明顯低于丹參組和澤瀉組(P<0.01)。見表4。

NAFLD大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量較正常組明顯降低(P<0.01)，TXB2含量明顯升高(P<0.01)。丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量明顯升高(P<0.01或P<0.05)，血漿TXB2含量明顯降低(P<0.01)。其中，丹澤組血漿TXB2含量明顯低于東寶甘泰對照組(P<0.01)，而丹澤組血漿TXB2含量低于丹參組和澤瀉組(P<0.05)。見表4。

3 討論

中醫(yī)基本理論將非酒精性脂肪肝歸屬于“痰濁”“血瘀”“癥瘕”“積聚”等范疇。本研究認(rèn)為，現(xiàn)代生活水平較高，人們往往嗜食肥甘，又久坐少動(dòng)，使脾胃運(yùn)化失調(diào)，痰濁內(nèi)生，氣血阻滯，致肝失條達(dá)而發(fā)為本病，故痰濕瘀血為非酒精性脂肪肝的主要病理基礎(chǔ)，故以活血化痰為基本治法[9]。本研究篩選出臨床常用的治療非酒精性脂肪肝的中藥丹參和澤瀉，丹參活血祛瘀、涼血消癰、養(yǎng)血安神，現(xiàn)代研究證實(shí)其具有改善血液循環(huán)、抗菌消炎、抗氧化、抗凝血、抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用[4-5]。澤瀉能夠利水濕、消痰濁，具有抗血栓、抗血小板聚集和抑制斑塊的作用[7]。

表4 各組大鼠ET-1、6-Keto-PGF1α and TXB2的變化

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉能明顯降低NAFLD模型大鼠血清TC、TG、FFA含量，降低ALT和AST的活性，呈現(xiàn)出良好的降脂和保肝作用。FFA可能是氧化應(yīng)激的根源，高脂飲食，血清FFA大量增加，TG大量蓄積在肝細(xì)胞內(nèi)，使線粒體氧化速度代償性加快，大量FFA氧化生成 ROS，超過機(jī)體抗氧化機(jī)制清除能力將引起氧化應(yīng)激。SOD是體內(nèi)酶類自由基清除劑，過氧化的產(chǎn)物MDA的大量增加證明機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增多，導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化和肝細(xì)胞死亡，從而加重脂肪肝[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉能增強(qiáng)NAFLD大鼠血清SOD活性，降低MDA含量，證明其良好的抗氧化作用。正常情況下ALT和AST存在于肝細(xì)胞內(nèi)，肝臟損傷時(shí)，其從肝細(xì)胞中釋放入血，因而通過檢測血清中ALT和AST的活性能夠反映丹參、澤瀉對NAFLD大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)中丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉能降低NAFLD大鼠血清ALT和AST活性，提示其對肝臟具有保護(hù)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞功能異常會(huì)引起血管舒縮失衡、內(nèi)皮滲透性增加、血小板聚集等。有研究證實(shí)：NAFLD患者普遍存在超重、血脂高、肝功異常、空腹血糖偏高及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等[11]。內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮( NO)、血栓素(TXA)、前列環(huán)素(PGF)為具有強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮和舒張作用的血管活性物質(zhì)，其中，ET與TXA為血管收縮因子，NO與PGF為血管舒張因子，相互協(xié)調(diào)，維持血管正常的收縮和舒張。非酒精性脂肪肝會(huì)引起血管內(nèi)皮功能異常，如血管舒張因子分泌相對減少，血管收縮因子分泌相對增多[12]。ET在肝臟合成，有3種異構(gòu)體，其中，在肝臟合成的ET-1是作用最強(qiáng)的一種，其含量增加會(huì)引起肝血竇收縮，肝循環(huán)障礙及肝細(xì)胞缺氧，加重脂質(zhì)過氧化，直接損傷肝細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化[13-14]。TXB2、6-Keto-PGF1α是人體內(nèi)微循環(huán)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分，二者相互拮抗并協(xié)調(diào)，防止血栓形成。TXB2增多，6-Keto-PGF1α減少會(huì)影響肝臟微循環(huán)，導(dǎo)致肝細(xì)胞功能障礙，變性壞死及纖維化[15]。

本研究結(jié)果顯示，丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉水煎劑能明顯改善血中6-Keto-PGF1α、ET、TXB2含量的異常變化，提示丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉水煎劑可能通過調(diào)節(jié)ET和6-Keto-PGF1α、TXB2的分泌和釋放，達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮功能、降低脂質(zhì)過氧化的作用，這可能是其防治NAFLD的分子機(jī)制之一。