李原野，李敏，李桂黎，黃迪，徐志文，朱玲，岳建國*

（1.四川省成都市動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）和豬細小病毒（PPV）都存在使患病母豬受孕率降低，流產(chǎn)率增加，產(chǎn)死胎或木乃伊胎；患病仔豬多系統(tǒng)功能紊亂等情況[1-3]。臨床上對這兩種病的混合感染很難做出鑒別診斷，故本研究建立了可以同時檢測豬圓環(huán)病毒3 型和豬細小病毒的雙重PCR 方法，以了解四川地區(qū)PCV3和PPV混合感染的情況，為新出現(xiàn)的PCV3的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病毒和病料 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）陽性病料、豬細小病毒（PPV）、大腸桿菌，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心保存。67份臨床組織樣品采集自四川省眉山市、青神縣、洪雅縣等大型規(guī)?；i場。

1.2 主要試劑 Trizol、Taq PCR Master Mix、pMD19-T 載體、DL2000 DNA Maker、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均購自生物工程（上海）有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)，購自寶生物（大連）有限公司。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計與合成 PPV NSP-1 基因的保守性較好，是分子診斷的常用目的片段；而PCV3的高度保守序列是ORF2基因。根據(jù)GenBank已發(fā)表的PCV3（Accession：MF139082.1）、PPV（Accession：MF447833.1）基因的核苷酸序列，分別設(shè)計一對特異性引物PCV3-F、PCV3-R 和PPV-F、PPV-R，其擴增產(chǎn)物片段的大小分別為651bp 和353bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（詳見表1）。

表1 引物序列與產(chǎn)物長度

2.2 樣品處理以及病毒核苷酸的提取 將從67份疑似PCV3和PPV病料中篩選出來的5份PCV3陽性病料和17份PPV陽性病料，分裝并編號。按照編號的病料（肺組織、肺淋巴結(jié)、流產(chǎn)胎兒）取樣5 g，放入研缽中，剪碎至無明顯的顆粒狀，加入液氮進行研磨，磨至粉末狀，加入適量的生理鹽水，將病料進行10 倍稀釋，-20 ℃反復(fù)凍融3 次，12 000 r∕min 瞬離20 s，取上清至EP 管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

用Trizol 法[4]提取PRRSV、PRV、CSFV、PEDV的病毒液以及研磨病料的總RNA，放置-80 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的總RNA 分別使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 單項PCR 擴增 將上面提取的cDNA 作為模板，通過對引物量的優(yōu)化、模板稀釋梯度優(yōu)化、退火溫度的優(yōu)化等探索最佳反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)25 μL 反應(yīng)體系最佳，該反應(yīng)體系為：2×PCR Mix Buffer 12.5 μL，上下游引物各1 μL（濃度為10 μM），cDNA模板2 μL，剩余通過加ddH2O進行補充。PCR反應(yīng)程序如下：

PCV3：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃7 min。PPV：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共30個循環(huán)；72 ℃7 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4 目的片段的克隆及回收 使用膠回收試劑盒將瓊脂糖電泳出的目的條帶回收，將回收的目的條帶連接至pMD19-T 載體，再轉(zhuǎn)化入DH5α克隆菌中，挑取陽性克隆菌送至生物工程（上海）有限公司測序，將經(jīng)測序鑒定后的陽性樣品進行擴大培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有兩個目的片段的兩種質(zhì)粒作為雙重PCR的反應(yīng)模板。

2.5 雙重RT-PCR方法的建立以及反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.5.1 PCV3、PPV 雙重PCR 反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化 以PCV3和PPV各自反應(yīng)的最佳退火溫度為基礎(chǔ)，運用Primer 6.0 軟件預(yù)測雙重PCR 的最佳退火溫度范圍，設(shè)置多個梯度的退火溫度（51.2、

52.0、52.8、53.7、54.5、55.2、56.1、57.2、58.4、59.8 ℃）進行反應(yīng)，最終篩選出最佳退火溫度。

2.5.2 PCV3、PPV雙重PCR反應(yīng)引物量的優(yōu)化 以單項PCR為基礎(chǔ)，進行25 μL的雙重PCR試驗，加入濃度為10 μM 的不同引物量（0.5、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 μL）分別進行反應(yīng)，最終篩選出最佳引物量。

2.6 特異性試驗 運用已經(jīng)建立的雙重PCR，取等量PRV 病毒的DNA 以及RNA 病毒PRRSV、CSFV、PEDV反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進行反應(yīng)，并用水代替模板陰性對照，將PCV3 和PPV 兩種陽性病料進行PCR擴增，擴增出的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分析。

2.7 敏感性試驗 將兩種含PCV3和PPV基因的重組質(zhì)粒用核酸蛋白儀測定濃度，然后分別以100～108的濃度梯度稀釋，利用已經(jīng)優(yōu)化好的PCR 反應(yīng)體系進行PCR 擴增，通過1.5%凝膠電泳，確切找出出現(xiàn)陽性條帶的最高稀釋濃度，推算其最低檢出濃度。

2.8 重復(fù)性試驗 將PCV3和PPV陽性病料提取出的DNA，利用所建立的雙重PCR方法分別進行檢測，重復(fù)5次，用于驗證所建方法的重復(fù)性。

2.9 雙重PCR 和單項PCR 的臨床應(yīng)用 用建立好的雙重PCR 方法對67 份臨床組織樣品進行檢測，同時用本實驗室已經(jīng)建立的兩種病毒的單項PCR作檢測，產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以驗證該方法的實用性。

3 結(jié)果

3.1 單項PCR 擴增 將從陽性病料中提取的DNA 運用本實驗室已經(jīng)建立的反應(yīng)體系進行退火溫度的優(yōu)化，結(jié)果呈現(xiàn)的目的條帶與預(yù)期353 bp 和651 bp 相一致，同時得出最佳的退火溫度為：PCV3 53 ℃，PPV 56 ℃。

3.2 雙重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.2.1 退火溫度的優(yōu)化 雙重PCR 反應(yīng)的最佳退火溫度在54.5 ℃～55.2 ℃之間，所以選取55 ℃作為該方法的最佳退火溫度。

3.2.2 引物量的優(yōu)化 引物的最佳用量為1 μL，濃度均為10 μM。

3.3 雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)上述所知的反應(yīng)最佳退火溫度與最佳引物量，對雙重PCR的反應(yīng)條件進行優(yōu)化，通過對退火時間、延伸時間和循環(huán)數(shù)的優(yōu)化，最終得到最佳的PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共33個循環(huán)；72 ℃7 min。

3.4 雙重PCR的特異性檢測 運用上述最佳反應(yīng)條件及最佳反應(yīng)體系，進行雙重PCR反應(yīng)的特異性檢測。結(jié)果表明，只有陽性病料擴增出了條帶，其余病毒未擴增出條帶（圖1），體現(xiàn)出該反應(yīng)具有特異性。

圖1 雙重PCR的特異性檢測

3.5 雙重PCR 的敏感性測定 將兩種質(zhì)粒按照100～108濃度標(biāo)準(zhǔn)稀釋，運用已經(jīng)建立好的雙重PCR 方法將兩種質(zhì)?；旌希⑦M行擴增反應(yīng)，結(jié)果表明稀釋到108濃度時，PCV3 和PPV的混合質(zhì)?？梢詳U增出條帶（圖2），因此，可以推算出PCV3、PPV 的最低檢出量為3.12×105copies∕μL。

圖2 雙重PCR的敏感性檢測

3.6 雙重PCR的重復(fù)性檢測 運用所建立的雙重PCR方法對含有PCV3和PPV的陽性病料檢測5 次后，結(jié)果顯示一致（圖3），表明本方法的重復(fù)性較好。

圖3 雙重PCR的重復(fù)性檢測

3.7 雙重PCR的臨床應(yīng)用 將從成都周邊地區(qū)采集的67 份病料提取總DNA，根據(jù)本文所建立的雙重PCR 方法進行檢測，檢測過程中設(shè)置陰性、陽性對照。將PCR 產(chǎn)物各吸取10 μL 進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：PCV3單一感染率為7.46%（5∕67），PPV 單一感染率為25.37%（17∕67），PCV3+PPV 復(fù)合感染率為1.49%（1∕67）。該結(jié)果與單項特異性PCR檢測結(jié)果完全符合。

表2 雙重PCR檢測67份病料PCV3和PPV的結(jié)果

表3 單項PCR與雙重PCR的檢測結(jié)果對比

3.8 目的片段的基因序列驗證 運用建立的雙重PCR方法擴增出目的片段，對擴增產(chǎn)物進行測序，所得序列經(jīng)過NCBI BLAST比較分析，結(jié)果表明，PCV3 的擴增序列與參考毒株（MF139082.1）的同源性為99%，PPV 的擴增序列與參考毒株（MF447833.1）的同源性為99%。證明運用本方法可以成功擴增出PCV3 和PPV 的目的片段，也證實該方法具有較好的特異性，在實驗室診斷上具有很大的價值。

4 結(jié)論

本次建立的雙重PCR 方法可在一個反應(yīng)體系中實現(xiàn)PCV3 和PPV 混合基因的同時擴增，最終擴增出的目的條帶與參考毒株的同源性高達99%，表明其特異性較好；所檢出的最低拷貝數(shù)為3.12×105copies∕μL，靈敏度較高。運用該方法對67份臨床樣品進行檢測，其最終結(jié)果與單項PCR的符合率為100%。本研究首次建立了可以同時檢測PCV3 和PPV 的雙重PCR 方法，對這兩種病的診斷更加快速、簡便、準(zhǔn)確，為臨床上PCV3 和PPV 混合感染的鑒別診斷以及流行病學(xué)分析提供了重要的技術(shù)支持?！?/p>