錢(qián)嘉怡 陳劍 張靜 劉曉 王春雷

摘要：植物精油是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，被應(yīng)用到了醫(yī)學(xué)、日用化工、食品、養(yǎng)殖等各領(lǐng)域。以施肥過(guò)量的土壤和豆梨幼苗為試驗(yàn)對(duì)象，研究不同濃度植物精油在不同處理時(shí)間對(duì)土壤修復(fù)和梨苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明：（1）土壤有機(jī)碳和總氮含量、有效磷含量、速效鉀含量在施用10%的植物精油后顯著降低，48 h后銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量顯著降低，但施用精油對(duì)土壤機(jī)械組成和酸堿性沒(méi)有明顯改變。（2）梨苗的過(guò)氧化物酶（POD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、脯氨酸（Pro）含量、葉綠素含量、根系活力在施用精油后都有顯著的增加，表明使用植物精油后作物抵抗逆境脅迫的能力有所提高，而超氧化物歧化酶（SOD）活性在處理8 d后有所降低，丙二醛（MDA）含量在10%的植物精油處理后先升后降，表明在開(kāi)始時(shí)有一定迫害，但處理8 d后逆境脅迫基本解除。因而，10%的植物精油可以改良鹽漬化土壤，促進(jìn)梨苗根系生長(zhǎng)，還可以提高梨苗抗逆性，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：植物精油;土壤機(jī)械組成;豆梨幼苗;抗氧化酶;根系活力;土壤修復(fù);抗逆性

中圖分類(lèi)號(hào)： X53;S661.201 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0142-06

在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化肥農(nóng)藥的長(zhǎng)期過(guò)量使用導(dǎo)致耕地出現(xiàn)氮磷鉀積累等一系列問(wèn)題。近年來(lái)，可持續(xù)發(fā)展已成為農(nóng)業(yè)發(fā)展主流。修復(fù)土壤并促進(jìn)作物更好生長(zhǎng)已成為農(nóng)業(yè)研究人員需要解決的重要問(wèn)題。

植物精油的原料一般為芳香植物的葉、根、皮、花和果等，是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，近年來(lái)，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也被逐漸引入，如植物精油可以作為除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑等，也可以用于果蔬保鮮[2]。柑橘類(lèi)精油主要來(lái)源于柑橘類(lèi)水果的果皮，其主要成分為萜類(lèi)物質(zhì)、倍半萜烯碳?xì)浠衔锛捌溲苌锏萚3]。目前，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的研究表明，植物精油中酚類(lèi)物質(zhì)、萜類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化性、抑菌性等特性。人們?cè)谏a(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，植物精油可以促進(jìn)作物在施肥過(guò)量導(dǎo)致的氮磷鉀積累土壤上生長(zhǎng)，但其機(jī)制并不清楚。本試驗(yàn)擬從土壤和作物自身2方面進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)內(nèi)于2018年8月至2019年3月進(jìn)行。

1.2 植物精油來(lái)源

本試驗(yàn)使用的植物精油由10%柑橘精油和90%蒸餾水組成。

1.3 土樣采集與處理

土壤取自揚(yáng)州大學(xué)園藝試驗(yàn)站溫室大棚，棚內(nèi)土壤經(jīng)多年栽培，存在明顯鹽漬化特征。去除土壤中的雜草、石塊等雜物后，整地做畦、劃分區(qū)域，形成9個(gè)邊長(zhǎng)為0.6 m的正方形試驗(yàn)小區(qū)，各小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行，其寬度為0.4 m。將126 mL處理液均勻噴施于每個(gè)小區(qū)土壤表面。稀釋10倍（10%）的處理液中包含植物精油12.6 mL、蒸餾水113.4 mL，稀釋100倍（1%）的處理液中包含植物精油 1.26 mL、蒸餾水124.74 mL，對(duì)照組使用126 mL的蒸餾水。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)。24、48 h后采集土樣，樣品采集深度為0～20 cm。將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，自然風(fēng)干后碾碎，過(guò) 1 mm 篩后待用。

1.4 梨苗處理

梨幼苗為砧木豆梨幼苗。豆梨種子采集于揚(yáng)州大學(xué)果樹(shù)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)層積打破休眠后播種于穴盤(pán)中，于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育，定期澆水，苗期為50～60 d時(shí)進(jìn)行處理。根據(jù)土樣試驗(yàn)結(jié)果，噴施稀釋10倍（10%）植物精油于穴盤(pán)基質(zhì)中，按照“1.3”節(jié)中土壤處理的用量進(jìn)行噴施，對(duì)照噴施蒸餾水。處理后3、8 d進(jìn)行采樣，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.5 植物精油對(duì)土壤的影響

1.5.1 土樣機(jī)械組成測(cè)定 參照李朝英等的方法[4]，稱(chēng)取土樣，潤(rùn)濕后加入分散劑，搖勻加熱，保持沸騰30 min，制備懸浮液，冷卻后定容，使用甲種比重計(jì)進(jìn)行土壤機(jī)械組成測(cè)定。

1.5.2 土樣pH值測(cè)定 參照王赟峰的方法[5]，取土樣，加去二氧化碳的水，1 ∶ 2.5（體積比）混合攪拌靜置后，采用pH值儀測(cè)定上清液pH值。

1.5.3 土壤有機(jī)碳（SOC）含量測(cè)定 參照蔣溢等的方法[6]，向50 mL離心管中加入2 g土壤樣品（約含15 mg碳）和25 mL高錳酸鉀，振蕩1 h后 4 000 r/min 離心5 min，在565 nm處采用分光光度計(jì)測(cè)定用去離子水稀釋250倍上清液的吸光率，以無(wú)土樣的空白組與土壤樣品組的吸光率差值來(lái)表示高錳酸鉀濃度的變動(dòng)，進(jìn)而計(jì)算出氧化的碳量。

1.5.4 土壤總氮（TN）、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的測(cè)定 總氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，具體參照文獻(xiàn)[7]。取0.5 g土樣，加入1.7 g混合催化劑，經(jīng)過(guò)濃硫酸消煮1 h后生成硫酸銨，通過(guò)堿化蒸餾出氨，蒸餾出的氨被硼酸吸收后，用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定至終點(diǎn)，計(jì)算土壤全氮含量。銨態(tài)氮含量的測(cè)定采用納氏試劑比色法，具體步驟參照弓曉峰等的方法[8]。稱(chēng)取土樣10 g，用20%的NaCl溶液進(jìn)行溶解，用定性濾紙過(guò)濾振蕩后的溶液。取濾液 5 mL，稀釋4倍后與1 mL酒石酸鉀鈉、1.5 mL 20% NaOH混合搖勻，靜置15 min后加入納氏試劑，定容至 25 mL，測(cè)定390 nm處吸光值。硝態(tài)氮含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，具體步驟參照宋歌等的方法[9]。取 2 mol/L 的KCl溶液50 mL，加入5 g土樣，振蕩1 h后靜置5 min，然后過(guò)濾。使用分光光度計(jì)在 220 nm 和 275 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算硝態(tài)氮濃度。

1.5.5 土壤有效磷（AP）和速效鉀（AK）含量測(cè)定 配制好Mchlich3浸提液后，按馮艷紅的方法[10]，在三角瓶中裝入2.5 g土樣后，加入M3浸提液 25 mL，經(jīng)過(guò)5 min振蕩后進(jìn)行干過(guò)濾。將濾液、水和顯色劑按照1 ∶ 4 ∶ 5（體積比）混勻，經(jīng)過(guò)30 min靜置后，使用分光光度計(jì)在660 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算有效磷含量;濾液通過(guò) 2 ∶ 23（體積比）進(jìn)行稀釋搖勻后，使用火焰光度計(jì)測(cè)定速效鉀含量。

1.6 抗氧化酶活性測(cè)定方法

采用董紅平的方法[11]，并加以改進(jìn)，制取酶液，置于0～4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法。測(cè)定時(shí)，調(diào)零試管加20 μL緩沖液遮光處理，對(duì)照試管加20 μL緩沖液，測(cè)試試管加20 μL酶液。每支試管都加入3 mL的SOD反應(yīng)液，4 000 lx光照下30 min，560 nm處進(jìn)行比色。1個(gè)活力單位用1 g植物鮮質(zhì)量反應(yīng)1 min對(duì)NBT光化還原產(chǎn)生50%的抑制來(lái)表示[12-13]。

1.6.2 過(guò)氧化物酶（POD）活性 使用愈創(chuàng)木酚法，配置反應(yīng)液，在470 nm下測(cè)定吸光值，測(cè)定時(shí)，3 mL 反應(yīng)液中加酶液20 μL，調(diào)零柱改為加20 μL濃度為20 mmol/L的KH2PO4，每次讀數(shù)間隔1 min。1個(gè)活力單位用1 min吸光度減少0.01來(lái)表示[12，14]。

1.6.3 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性 利用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性，以磷酸緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)定波長(zhǎng)為240 nm，1個(gè)活力單位用1 min吸光度減少0.01定義來(lái)表示。

1.7 葉綠素含量的測(cè)定方法

采用分光光度法測(cè)定葉綠素含量，具體操作借鑒魏曉飛等的方法[15]，通過(guò)無(wú)水乙醇調(diào)零，使用分光光度計(jì)在663、645 nm處測(cè)定吸光度，葉綠素a、b的含量按照Aron公式計(jì)算。

1.8 根系活力測(cè)定方法

根系活力測(cè)定的具體步驟參照陳明輝等的方法[16]，取0.1 mol/L pH值為7.5的磷酸緩沖液和0.5%的（2，3，5-三苯基氯化四氮唑TTC）溶液各 5 mL，混勻后將梨幼苗根尖泡入其中，37 ℃恒溫水浴暗反應(yīng)1 h后，立即終止反應(yīng)，終止反應(yīng)可以通過(guò)加入2 mL 1 mol/L的H2SO4來(lái)完成。紅色部分表示存在活躍的脫氫酶。去除根尖上的水分，取紅色根尖部分加入乙酸乙酯并研磨，將提取液定容至 10 mL，在485 nm處測(cè)定吸光值，以乙酸乙酯為空白對(duì)照。由TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線得TTC還原量。

1.9 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定方法

按趙華軍的方法[17]測(cè)定丙二醛含量。

1.10 脯氨酸含量測(cè)定方法

參照黃海霞的方法[18]測(cè)定脯氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油對(duì)氮磷鉀積累土壤的作用

2.1.1 植物精油對(duì)土壤機(jī)械組成的影響 土壤物理性質(zhì)主要由土壤的機(jī)械組成決定，其中就包括黏粒、粉粒、沙粒占比等。研究結(jié)果顯示，不同精油處理與對(duì)照相比，沙粒、粉粒、黏粒3個(gè)部分所占比例沒(méi)有明顯差異（圖1-A、圖1-B、圖1-C），表明植物精油不能改善土壤機(jī)械組成。pH值是土壤重要指標(biāo)，不同作物生長(zhǎng)都有最適pH值范圍。測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)多年耕作后，大棚土壤呈明顯酸性，其pH值在5.8左右。經(jīng)植物精油處理后，土壤pH值無(wú)明顯變化（圖1-D），表明植物精油并不能調(diào)整土壤酸堿度。

2.1.2 植物精油對(duì)土壤肥力和鹽分含量的影響 由于本研究選擇試驗(yàn)區(qū)域的土壤氮磷鉀元素積累是由常年施肥不當(dāng)引起的，為了研究植物精油對(duì)土壤的修復(fù)作用，研究了植物精油對(duì)該區(qū)域土壤中有機(jī)碳（SOC）、總氮（TN）、銨態(tài)氮（NH+4-N）、硝態(tài)氮（NO-3-N）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）含量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，噴施植物精油后，10%植物精油在處理24、48 h后都能顯著降低土壤有機(jī)碳含量，但1%精油處理與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（圖2-A）?？偟恳嘤邢嗤Y(jié)果，10%植物精油在處理24、48 h后都能顯著降低土壤總氮含量，但1%植物精油處理與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（圖2-B）。進(jìn)一步細(xì)分來(lái)看，10%植物精油在處理24 h后，并不能顯著降低銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量;但10%植物精油在處理48 h后，可顯著降低土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量（圖2-C、圖2-D），而土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量在1%植物精油處理作用下與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。此外，10%植物精油在處理24、48 h后能顯著降低土壤有效磷和速效鉀含量（圖2-E、圖2-F）;土壤在1%植物精油處理24 h后，有效磷、速效鉀含量顯著增加，但是在處理48 h后二者含量又有所回落，與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，10%植物精油處理能顯著降低土壤養(yǎng)分和鹽分含量。

2.2 植物精油對(duì)梨苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 植物精油對(duì)梨苗抗氧化酶活性的影響 根據(jù)前期施用植物精油對(duì)土壤養(yǎng)分和鹽分含量影響的試驗(yàn)結(jié)果可知，幾種處理中能夠顯著降低鹽漬化土壤鹽分含量的是10%植物精油處理48 h;將10%植物精油噴施到基質(zhì)中，處理72 h（3 d）和192 h（8 d）后測(cè)定梨幼苗抗氧化系統(tǒng)POD、SOD和CAT活性的變化情況。結(jié)果表明，噴施植物精油能夠顯著提高梨苗POD活性，處理3 d后POD活性約為對(duì)照組的3.5倍;處理8 d后POD活性為對(duì)照組的5.9倍（圖3-A）。SOD活性在噴施3 d后無(wú)明顯變化，處理8 d后顯著下降（圖3-B）。CAT活性在噴施3 d后無(wú)明顯變化，處理8 d后顯著升高，變化趨勢(shì)與SOD活性正好相反（圖3-C）。POD和CAT活性提高，有助于提升植物抗氧化能力。

2.2.2 植物精油對(duì)梨苗葉綠素含量的影響 向基質(zhì)中噴施10%植物精油后能夠顯著提高梨苗葉綠素a的含量（圖4-A），處理組葉綠素a的含量約為對(duì)照組的2.5倍。葉綠素b含量在噴施植物精油 8 d 后顯著降低（圖4-B）?？?cè)~綠素含量在噴施植物精油3 d后達(dá)到最大值，處理8 d后總?cè)~綠素含量略微降低了一些（圖4-C），但仍然顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組含量的1.3倍。

2.2.3 植物精油對(duì)梨苗損傷情況 為了研究植物精油是否會(huì)造成植株損傷，測(cè)定了梨苗根系活力及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量。研究發(fā)現(xiàn)，向基質(zhì)中噴施10%植物精油后，梨苗根系活力明顯提高（圖5-A），處理3 d后的根系活力約為對(duì)照組的3倍，處理8 d后根系活力約為對(duì)照組的4倍，說(shuō)明植物精油能夠顯著提高梨苗根系活力。MDA是反映細(xì)胞膜損傷情況的物質(zhì)，植物精油處理3 d后，幼苗內(nèi)的MDA含量顯著上升（圖5-B），但隨時(shí)間的推移，MDA含量恢復(fù)到正常水平。脯氨酸常被植物用來(lái)維持細(xì)胞滲透壓，抵御外界脅迫。研究表明，在噴施植物精油后，梨苗體內(nèi)脯氨酸含量明顯升高（圖5-C），說(shuō)明植物精油對(duì)梨苗有一定脅迫作用。

3 討論與結(jié)論

土壤機(jī)械組成是影響土壤物理性質(zhì)和養(yǎng)分含量的重要因素[18-19]。pH值是土壤重要的化學(xué)指標(biāo)，是土壤元素存在及有效性的直接影響者[20]。本研究中施用植物精油對(duì)土壤機(jī)械組成和酸堿度無(wú)顯著影響。土壤中的SOC是土壤有機(jī)物轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，本試驗(yàn)顯示，10%植物精油噴施后土壤中的SOC含量顯著下降，這可能因?yàn)榫吞幚砗笸寥乐械腟OC易被微生物分解而發(fā)生礦化反應(yīng)[21];另外，試驗(yàn)過(guò)程中使用的是風(fēng)干土，也可能會(huì)促進(jìn)土壤的礦化作用[22-23]。10%植物精油噴施后土壤中總氮含量也顯著降低。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上在施肥中采用土壤全氮、水解氮（包括無(wú)機(jī)態(tài)氮和一部分易分解的有機(jī)態(tài)氮）含量作為土壤供氮能力與水平評(píng)估的指標(biāo)[23]。本試驗(yàn)的土壤全氮含量超2 g/kg，居全國(guó)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的1級(jí)，銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的含量之和也超過(guò)水解氮一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，表明本試驗(yàn)土壤氮素豐富，且供氮能力較高。土壤中硝態(tài)氮含量降低往往與淋失有關(guān)，土壤中硝態(tài)氮含量越高則氮素淋失的可能性越大[24]，本研究中硝態(tài)氮含量的降低可能是植物精油導(dǎo)致了硝態(tài)氮的淋失。而銨態(tài)氮降低則與氨揮發(fā)有關(guān)[25]，噴施10%植物精油后表層銨態(tài)氮濃度降低，可能是因?yàn)?0%植物精油促進(jìn)氨揮發(fā)。因此，噴施10%精油后土壤中氮素含量的降低，可能是由硝態(tài)氮淋失、氨態(tài)氮揮發(fā)共同造成。磷是作物生長(zhǎng)的必需元素，影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育[26]。施用1%精油后，磷含量有所增加，說(shuō)明低濃度植物精油可有效提升土壤磷含量，其相關(guān)機(jī)制還不清楚。目前全國(guó)各地普遍存在化肥施用過(guò)量的現(xiàn)象，而作物都有其本身的有效磷閾值，土壤中高含量氮磷構(gòu)成農(nóng)田氮磷流失的潛在威脅[27]。本試驗(yàn)中土壤磷素含量遠(yuǎn)超國(guó)家分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)1級(jí)的規(guī)定，而土壤磷素的超標(biāo)，既會(huì)造成磷肥資源的浪費(fèi)，也易引起水體過(guò)營(yíng)養(yǎng)化，污染水環(huán)境。本試驗(yàn)中土壤速效鉀含量在10%精油處理48 h后降低至 292 mg/kg，仍高于全國(guó)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)1級(jí)的規(guī)定。鉀在酸性條件下易淋失[25]。本試驗(yàn)的土壤pH值均低于6.0，屬于酸性，因此10%植物精油噴施會(huì)降低土壤鉀濃度，但1%植物精油提高土壤速效鉀含量的原因尚不清楚。因此，10%植物精油能有效降低土壤中多種鹽分含量。

SOD、POD與CAT三者協(xié)同抵御活性氧的傷害，植物體氧負(fù)離子的清除受到逆境保護(hù)酶活性的直接影響，植物細(xì)胞膜的穩(wěn)定和正常生理代謝的維持也受其影響[28]。在本研究中，植物精油能夠增強(qiáng)梨幼苗的保護(hù)酶系統(tǒng)，提高SOD、POD和CAT的活性，可能會(huì)提高梨苗抵抗逆境脅迫的能力。植物精油對(duì)POD活性的提升效果顯著，并且隨時(shí)間變化POD活性呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì);CAT活性在處理8 d后顯著上升;對(duì)于SOD活性，10%植物精油對(duì)其在初期有一定提升作用，但隨時(shí)間推移活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)。通常情況下，植物體能夠自主清除多余的自由基，但是在逆境脅迫下活性氧含量超過(guò)閾值，脂質(zhì)過(guò)氧化等導(dǎo)致植物最終受害。脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一是MDA，因此可用MDA含量來(lái)反映細(xì)胞膜系統(tǒng)受害的程度[29]。在本試驗(yàn)中，10%植物精油噴施后，梨苗MDA含量表現(xiàn)為先升后降，處理結(jié)束后MDA含量接近對(duì)照植株水平，說(shuō)明植物精油的施用開(kāi)始對(duì)梨幼苗是有一定迫害的，但8 d后對(duì)其造成的逆境脅迫基本解除。植物葉綠素主要參與光合作用，本試驗(yàn)中，10%的植物精油處理后，梨苗葉綠素總量顯著提升，這有利于光合作用中的光吸收。但葉綠素b含量在處理8 d后有一定減少，這可能不利于植物對(duì)弱光的利用，對(duì)于弱光的吸收能力降低，這也可能是幼苗對(duì)逆境的一種生理反應(yīng)，以此緩解傷害[30]。根系是植物與土壤之間的重要連接體，它既是植物正常生長(zhǎng)的影響因素，也起到改良土壤的重要作用，并且能夠敏感地反映出周?chē)h(huán)境的變化。噴施精油后植物根系活力成倍增加，說(shuō)明根系能很好地吸收精油，并且根系活力的增加代表著植物能更好更快地對(duì)環(huán)境改變作出快速反應(yīng)。脯氨酸是植物最有效的滲透調(diào)節(jié)劑之一，是蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑[31]，有利于植物抗逆生理反應(yīng)的調(diào)動(dòng)[32]。本試驗(yàn)中，噴施精油后，脯氨酸含量均顯著高于對(duì)照，表明噴施精油后，幼苗能更迅速地對(duì)脅迫作出反應(yīng)。植物精油的施用對(duì)于梨幼苗生長(zhǎng)具有良好的作用，有助于提高植物的抗逆性、光合能力及根系活力等。

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