胡婕 羅玉端 毛林夏 李恒 魯海菊

摘要：為做好出口石榴鮮果產(chǎn)地檢疫和病原防治工作，以石榴果實干腐病病菌（Zythia versoniana）和木霉菌株（Trichoderma spp.）作為供試菌株，采用菌絲生長速率法和對峙培養(yǎng)法，測定8種常用化學(xué)農(nóng)藥和18株木霉菌株對石榴果實干腐病病菌的抑菌率。結(jié)果表明，450 g/L咪鮮胺、250 g/L丙環(huán)唑、30%苯醚甲環(huán)唑、10%氟硅唑、20%三唑酮、40%百菌清等6種化學(xué)農(nóng)藥對石榴果實干腐病病菌的抑制效果最好，抑菌率為100.0%，是理想的備用化學(xué)農(nóng)藥。在各供試木霉菌株中，木霉菌株P(guān)Z1對石榴果實干腐病病菌的抑菌率為63.5%，有望作為防治石榴果實干腐病的生防菌種資源。

關(guān)鍵詞：石榴干腐病病菌;鮮果;產(chǎn)地檢疫;木霉菌株;化學(xué)農(nóng)藥

中圖分類號： S436.67+9 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0116-05

石榴干腐病病菌可以通過氣流、雨水傳播，不僅危害石榴樹的枝干、新梢、花、葉片，更重要的是侵染石榴果實。石榴幼小果實可被侵染攜帶病原，具有潛伏侵染的特性，在貯藏后期造成鮮果變褐腐爛。石榴干腐病病菌是我國石榴鮮果出口風(fēng)險分析中的重要真菌病原之一，在韓國[1]、希臘[2]也有相關(guān)報道，其有效防治措施是我國石榴鮮果出口種植基地檢疫監(jiān)管的一項重要內(nèi)容。我國報道引起石榴干腐病的病原菌有石榴鮮殼孢（Zythia versoniana）[3-4]和石榴墊殼孢（Coniella granati）[5]。從菌落形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀來看，石榴鮮殼孢和石榴墊殼孢差異不明顯，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中菌絲均呈放射狀擴展，同心輪紋狀，后生黑褐色的分生孢子器[3-5]，鑒定結(jié)果不一致的原因可能與石榴產(chǎn)地地理環(huán)境差異有關(guān)。云南省蒙自市是我國石榴鮮果出口的主要產(chǎn)地之一，1999年隨著周又生等對石榴干腐病進行較全面系統(tǒng)地研究，該病得到了有效的控制[3]。直到2011年，蒙自產(chǎn)地石榴干腐病再次大暴發(fā)[3]，迄今石榴干腐病仍然是出口種植基地較為嚴重的病害，特別是在6月上中旬至7月上中旬間，若連續(xù)降雨或時晴時雨的高溫高濕條件下，病菌生長繁殖迅速，中等成熟度的果實5～7 d內(nèi)發(fā)病果達20%～30%，嚴重的達 40%～50%[3-5]。

適時使用化學(xué)農(nóng)藥仍是控制石榴果實干腐病的主要措施，常用的化學(xué)農(nóng)藥包括波爾多液[3]、多菌靈[6-7]、百菌清[3，7]、代森錳鋅[3]、甲基托布津[3，6]等。另一方面，病原菌對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生的抗藥性，伴隨而來的農(nóng)藥殘留和食品安全問題，使得在產(chǎn)地檢疫和監(jiān)管措施中，不但有必要檢監(jiān)測化學(xué)農(nóng)藥措施的有效性，對生物防治的穩(wěn)定性與成效評估也越來越重要[8-10]。李永慶等利用芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株防治石榴干腐病病菌，抑菌率在30%左右[11]。馬耀華等利用解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）防治石榴干腐病病菌，抑菌率達31.27%～81.89%[12]。魯海菊等利用木霉（Trichoderma）菌株防治石榴干腐病菌，抑菌率可達93%，可見木霉菌株對石榴干腐病病菌的拮抗作用顯著[13]。鑒于此，本試驗將測定8種出口種植基地常用的化學(xué)農(nóng)藥和18株木霉菌株對石榴果實干腐病病菌的抑菌率，以期為產(chǎn)地檢疫和監(jiān)管進一步開展化學(xué)和生物防治評價提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 石榴果實干腐病病原菌（Zythia versoniana）分離自云南蒙自產(chǎn)地的石榴干腐病病果果實;木霉（Trichoderma spp.）菌株：PZ1、抗三唑酮PZ1、抗氟硅唑PZ1、GM6、抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6、Y2、抗三唑酮Y2、GD1、抗三唑酮GD1、J1、J2、J3、J4、J5、JD3、GD3、GD5，均保存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)實驗室。

1.1.2 供試化學(xué)農(nóng)藥 供試化學(xué)農(nóng)藥相關(guān)信息詳見表1。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水。上述培養(yǎng)基配好后在121 ℃高壓滅菌30 min。材料均購自農(nóng)貿(mào)市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗時間與地點 于2018年8月25至26日前往云南蒙自石榴種植基地采集石榴干腐病病果并進行供試病原菌分離鑒定;于2018年9月25日至11月25日在紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)實驗室和蒙自海關(guān)綜合技術(shù)中心植物檢疫實驗室開展抑菌效果評估試驗。

1.2.2 菌株擴繁與菌塊制備 將分離、保存的石榴果實干腐病病菌、木霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板中，于28 ℃恒溫擴繁培養(yǎng)7 d后，采用直徑為5 mm的打孔器在培養(yǎng)基同一半徑周圍取菌塊備用。

1.2.3 測定常用化學(xué)農(nóng)藥對石榴果實干腐病病菌的抑菌率 采用菌絲生長速率法[7，11]，將450 g/L咪鮮胺、250 g/L丙環(huán)唑、30%苯醚甲環(huán)唑、10%氟硅唑、20%三唑酮、40%百菌清、80%多菌靈、70%甲基硫菌靈等8種殺菌化學(xué)農(nóng)藥按供貨說明書的使用濃度（表1）配制后，加入PDA培養(yǎng)液中，搖勻后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中備用。將石榴果實干腐病病菌菌塊接種于含藥PDA培養(yǎng)基平板中心位置，以石榴果實干腐病病菌菌塊接種到不含藥的PDA平板中心位置為對照。每個處理重復(fù)3次，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法[14]測定菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.4 測定木霉菌株對石榴果實干腐病病菌的抑菌率 采用對峙培養(yǎng)法[15]，將直徑為5 mm的木霉菌塊與石榴果實干腐病病菌菌塊兩兩組合，接種到距離平板中央相等的2個點上，以不接種木霉菌塊作為對照。每個處理重復(fù)3次，于28 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d 后，測定菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.5 抑菌率計算公式

抑菌率=dCK-dBdCK×100%。

式中：dCK表示對照病原菌菌落直徑，mm;dB表示含藥平板病原菌菌落直徑，mm。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncan's多重比較法進行統(tǒng)計分析，計算處理間的差異顯著性。采用Excel進行數(shù)據(jù)匯總并計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 常用殺菌化學(xué)農(nóng)藥對石榴果實干腐病病菌的抑制效果

由表2可知，經(jīng)Duncan's多重比較發(fā)現(xiàn)，450 g/L 咪鮮胺、250 g/L丙環(huán)唑、30%苯醚甲環(huán)唑、10%氟硅唑、20%三唑酮、40%百菌清等6種化學(xué)農(nóng)藥的病菌菌落直徑差異不顯著，對石榴果實干腐病病菌的抑菌率均達到100.0%，與其他2種藥劑的菌落直徑間差異極顯著（P<0.01）。80%多菌靈和70%甲基硫菌靈菌落直徑間差異極顯著（P<0.01），抑菌率分別為21.0%、0.0%。結(jié)果表明，450 g/L咪鮮胺、250 g/L丙環(huán)唑、30%苯醚甲環(huán)唑、10%氟硅唑、20%三唑酮、40%百菌清等6種化學(xué)農(nóng)藥對石榴果實干腐病病菌的抑制效果最好;80%多菌靈的抑制效果不理想，抑菌率小于50.0%;70%甲基硫菌靈對石榴果實干腐病病菌無抑制效果。

2.2 木霉菌株對石榴果實干腐病菌的抑制效果

由表3可知，經(jīng)Duncan's 多重比較發(fā)現(xiàn)，PZ1菌株與其他17株木霉菌株（GM6、Y2、GD1、J1、J2、J3、J4、J5、JD3、GD3、GD5、抗三唑酮PZ1、抗氟硅唑PZ1、抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6、抗三唑酮Y2、抗三唑酮GD1）病菌的菌落直徑間差異極顯著（P<0.01），抑菌率為63.5%，其他17株木霉菌株的抑菌率在5.4%～37.3%之間。結(jié)果表明， 在18株木霉菌株中，原始木霉菌株P(guān)Z1對石榴果實干腐病病菌的抑制效果較好;其他11株原始木霉菌株和6株抗藥性木霉菌株對石榴果實干腐病病菌的抑制效果均不理想。

在6個抗藥性木霉菌株中，抗三唑酮PZ1、抗氟硅唑PZ1菌株與PZ1菌株處理間病菌菌落直徑差異極顯著（P<0.01），抗三唑酮PZ1、抗氟硅唑PZ1菌株對石榴果實干腐病病菌的抑制效果均明顯低于PZ1菌株，說明木霉菌株P(guān)Z1與藥劑混用抑菌效果不理想;抗三唑酮GD1、抗三唑酮Y2菌株與GD1、Y2菌株處理間病菌菌落直徑差異極顯著（P<0.01），抗三唑酮GD1、抗三唑酮Y2菌株對石榴果實干腐病病菌的抑制效果均明顯低于GD1、Y2菌株，說明木霉菌株GD1、Y2與藥劑混用抑菌效果不理想;GM6菌株的抑菌率為22.4%，抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6菌株抑菌率分別為23.5%、26.8%，說明抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6菌株對石榴果實干腐病病菌的抑制效果相對于GM6菌株有一定的增效作用，但木霉菌株GM6與藥劑混用增效作用不顯著。

3 討論

目前選擇在石榴坐果后、套袋前噴灑殺菌化學(xué)農(nóng)藥，仍是出口種植基地防治石榴果實干腐病、防止出口石榴鮮果攜帶病原菌的主要措施，操作簡便且成效直接[16-19]。本次試驗篩選出口種植基地防治石榴干腐病常用的8種化學(xué)農(nóng)藥做室內(nèi)抑菌效果評估，結(jié)果表明，450 g/L咪鮮胺、250 g/L丙環(huán)唑、30%苯醚甲環(huán)唑、10%氟硅唑、20%三唑酮、40%百菌清等6種化學(xué)農(nóng)藥對石榴果實干腐病病菌的抑制效果最好，抑菌率均達100.0%，是防治石榴果實干腐病的理想化學(xué)藥劑。本次評估試驗結(jié)果表明，80%多菌靈對石榴果實干腐病病菌的抑制效果較差，而70%甲基硫菌靈對其無抑制效果。80%多菌靈、70%甲基硫菌靈的效果與魯海菊等的研究結(jié)果[7]相比，抑菌率分別偏低33.9%、25.8%?？赡苡捎诒敬卧囼灢捎玫氖窀筛〔≡蛛x自同年石榴產(chǎn)地發(fā)病的果實中，菌株活性和致病力均較強，相反使用保存時間較長的供試菌株容易出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，表現(xiàn)出藥劑高抑制作用，因此本次評估結(jié)果顯得更可靠。

既防治病蟲害，又防止抗藥性和化學(xué)農(nóng)藥劑量加大引起的農(nóng)藥殘留問題，是生物防治的重要意義之一[20-27]。木霉菌株對多種植物病原菌表現(xiàn)有拮抗活性，目前我國已用木霉菌劑成功防治玉米小斑病[28]、柑橘綠霉病[29]、黃瓜枯萎病[30]、人參銹腐病[31]、香蕉枯萎病[32]、葡萄灰霉病[33]等多種農(nóng)作物病害，有望用于防治石榴果實干腐病。本次試驗的各供試木霉菌株中，PZ1菌株對石榴果實干腐病病菌的抑制效果較好，抑菌率為63.5%，有望作為防治石榴果實干腐病的生防菌種資源。本次試驗評估的18株木霉菌株，除PZ1菌株評估結(jié)果較好，其他17株菌株抑菌效果均不理想。其中，Y2、J1、J2、J3、J4、J5、JD3、GD3、GD5、GM6菌株與魯海菊等的研究結(jié)果相比，抑菌效果相對偏低22.2%～36.2%[15，34];Y2菌株與魯海菊等研究的木霉菌對萬壽菊葉斑病、枇杷根腐病P3.1、P3.5菌株的抑制效果一致，與魯海菊等研究木霉菌對枇杷根腐病P3.6菌株的抑制效果相對偏低19.3%，與魯海菊等研究的木霉菌對石榴枯萎病病菌的抑制效果相對偏高18.5%[34];抗三唑酮Y2菌株與魯海菊等的抗撲海因Y2菌株對石榴枯萎病病菌的抑制效果一致，與魯海菊等的抗撲海因Y2菌株對萬壽菊葉斑病菌、枇杷根腐病菌P3.6、P3.5、P3.1菌株的抑制效果相對偏低12.7%～16.8%[34]。在6個抗藥性木霉菌株中，除抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6菌株與GM6菌株抑菌作用相比有一定的增效作用外，抗三唑酮PZ1、抗氟硅唑PZ1、抗三唑酮Y2、抗三唑酮GD1等4個抗藥性菌株相對其原始菌株均無增效作用。這與吳石平等利用木霉菌株與殺菌化學(xué)農(nóng)藥混用防治西瓜枯萎病、黃瓜和草莓灰霉病、蘋果輪紋病等研究結(jié)果[35-39]有明顯差異。這些差異可能與生防菌株對病原菌抑制基因的遺傳穩(wěn)定性[40]，以及與化學(xué)農(nóng)藥的交互抗性有關(guān)。目前生物防治技術(shù)因其穩(wěn)定性問題使大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)實際還存在一定的局限和障礙。魯海菊等通過對木霉菌株的多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)促使菌株的耐藥性遺傳穩(wěn)定，以及紫外誘導(dǎo)改良木霉菌株、優(yōu)化木霉菌株與化學(xué)農(nóng)藥間的交互抗性[41-42]，這些方法是否能夠解決木霉菌株對石榴果實干腐病病菌抑制效果的穩(wěn)定性問題，還有待進一步研究。

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