雷樂 張玲莉 楊杰*

1. 上海體育學(xué)院，上海 200438 2. 華南師范大學(xué)，廣東 廣州 510631

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有多向分化能力的成體干細(xì)胞，位于骨髓腔內(nèi)。在一定的微環(huán)境或培養(yǎng)條件下，BMSCs可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等[1-2]。而成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量和協(xié)調(diào)活動決定了骨骼重塑和骨量的變化，因此BMSCs對骨骼發(fā)育和骨轉(zhuǎn)換起著至關(guān)重要的作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路與BMSCs的增殖、分化與凋亡有密切相關(guān)。

Notch信號通路在細(xì)胞的整個生命活動中扮演著重要的角色，是一條保守而重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在神經(jīng)、心血管和骨骼等系統(tǒng)中都有重要的意義。Notch信號通路對骨骼細(xì)胞活動和骨骼發(fā)育尤為關(guān)鍵[3]，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，其功能異?？蓪?dǎo)致各種累及顱面與骨骼的先天性疾病[4]。且受多種因素的影響，譬如外源性藥物或因子調(diào)節(jié)Notch信號通路的關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)，機械載荷能夠激活Notch信號通路的靶基因，從而調(diào)節(jié)BMSCs的增殖與分化。

本文通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，旨在闡述外源性藥物和因子和機械載荷介導(dǎo)Notch信號通路對BMSCs的影響，并總結(jié)了Notch信號通路在骨代謝疾病中的研究近況。

1 Notch信號通路與BMSCs的關(guān)系概述

Notch最早是在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)的一種基因，因該基因可以導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣缺損，故被稱為Notch[5-6]。Notch信號通路由幾種高度保守的成員組成，主要包括受體、配體、CSL蛋白及Notch信號的效應(yīng)分子[7]。在哺乳動物中Notch家族主要有4種受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、5種配體(DLL1、DLL3、DLL4、Jag1、Jag2)，均屬于單次跨膜蛋白。CSL蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，其名稱來源于哺乳動物(CBF1，也稱RBP-Jκ)、果蠅[Su(H)]與線蟲(Lag-1)的三個首字母，因為CSL蛋白主要存在于這三種物種之中。Notch信號效應(yīng)分子主要為HES，是進化保守的基本螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，HES家族中有6個成員，其中HES1、HES5、HES7在Notch信號通路中發(fā)揮重要作用，是Notch信號通路的下游靶基因[8]。Notch信號通路的激活主要經(jīng)過三次酶切反應(yīng)和蛋白水解：Notch受體合成后首先在高爾基體內(nèi)被切割，為第一次酶切(S1)；之后在胞外被腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)轉(zhuǎn)化酶酶切為第二次酶切(S2)；酶切產(chǎn)生的不穩(wěn)定過渡多肽被γ-分泌酶復(fù)合體識別并進一步將Notch受體的胞內(nèi)段酶切，為第三次酶切(S3)，三次酶切后Notch信號通路被激活，釋放出具有活性的Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain，NICD)進入細(xì)胞質(zhì)，在胞質(zhì)內(nèi)移動進入細(xì)胞核，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄抑制因子CSL/CBF-1蛋白結(jié)合，將轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)錄活化因子，作用于Notch信號通路的靶基因HES(hairy/enhancer of split)、HEY(hairy/enhancer of split with YRPW motif family members)，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化。

Notch信號通路在骨代謝中有重要作用，當(dāng)其出現(xiàn)異常時會導(dǎo)致骨發(fā)育失調(diào)、骨質(zhì)疏松、骨軟化等疾病。其上下游基因遺傳突變也會導(dǎo)致一系列骨疾病[9]。Notch信號通路對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)均有重要影響。DSL配體誘導(dǎo)Notch受體的切割和NICD的產(chǎn)生。成骨細(xì)胞前體中Notch1的活化可通過抑制osterix(Osx)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白抑制成骨細(xì)胞生成，影響骨形成；破骨細(xì)胞前體中的Notch2 NICD與NF-κB相關(guān)，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞(Nfatc)1轉(zhuǎn)錄和破骨細(xì)胞增加，骨形成受損和骨吸收增加導(dǎo)致骨量減少(如圖1左側(cè)所示)。成骨細(xì)胞中Notch1的激活可誘導(dǎo)Rankl抑制劑骨保護素(OPG)，從而抑制松質(zhì)骨吸收。骨細(xì)胞中Notch1激活抑制硬化蛋白(Sclerostin)和Dkk1，增強Wnt信號，增加皮質(zhì)骨形成。松質(zhì)骨吸收減少和皮質(zhì)骨形成增強導(dǎo)致骨量增加[10](如圖1右側(cè)所示)。Zanotti等[10]認(rèn)為，Notch通過抑制Wnt信號傳導(dǎo)并與Runx2相互作用來抑制成骨細(xì)胞成熟，而在成熟的成骨細(xì)胞中Notch抑制其分化功能，Notch1可抑制破骨細(xì)胞生成，而Notch2則通過與NfκB相互作用來誘導(dǎo)Nfatc1與破骨細(xì)胞分化。同時，Deregowski等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1活化抑制成骨細(xì)胞分化，Notch能夠抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，但不抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，Notch信號通路下游的HES和HEY蛋白能夠抑制Runx2的功能，從而抑制成骨細(xì)胞的生成[12]。Ji等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在BMSCs分化為成骨細(xì)胞時未被激活，在成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞時被激活，而BMSCs成骨分化早期會抑制Notch信號傳導(dǎo)促進BMSCs向成骨細(xì)胞分化，積累成熟的成骨細(xì)胞，而到成骨細(xì)胞分化晚期，Notch信號傳導(dǎo)抑制成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化與礦化。Notch抑制MSC向成骨細(xì)胞的分化并促進成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化(如圖2所示)。也有研究[13]表明Notch通路對BMSCs的調(diào)節(jié)并不是單一的促進或抑制，而是在全身或局部相關(guān)因子調(diào)節(jié)下的結(jié)果。Notch信號通路對成骨細(xì)胞的作用更多是建立在與其他信號通路的相互作用，這些相互作用調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的機制尚未明確，有待進一步研究。

2 不同干預(yù)手段介導(dǎo)Notch信號通路對BMSCs的影響

2.1 外源性藥物或因子介導(dǎo)Notch信號通路對BMSCs的影響

圖1 Notch信號傳導(dǎo)和骨重建調(diào)節(jié)[13]Fig.1 Notch signaling pathway and bone remodeling regulation

圖2 成骨細(xì)胞分化中Notch信號傳導(dǎo)模型Fig.2 Notch signaling model in the osteoblast differentiation

在國內(nèi)，藥物干預(yù)對Notch信號通路的影響以中成藥居多。張穎等[14]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方扶芳藤合劑含藥血清能上調(diào)大鼠BMSCs中Notch信號通路關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)，激活Notch信號通路。韓亞力等[15]使用成分為骨碎補總黃酮(davallia mariesil flavones，DMF)的強骨膠囊進行動物實驗，發(fā)現(xiàn)DMF能下調(diào)大鼠Notch1與Hes1蛋白表達(dá)量，改善大鼠骨質(zhì)疏松，提示其作用機制可能與Notch信號通路被抑制有關(guān)。周靈通[16]實驗發(fā)現(xiàn)固本增骨方含藥血清能上調(diào)Notch1 mRNA、下調(diào)CBF1 mRNA的表達(dá)，促進BMSCs增殖與成骨分化。張志明等[17]發(fā)現(xiàn)葛根素能使細(xì)胞DLL4含量增加，促進BMSCs骨向分化。鄧宇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠通過上調(diào)HES1、Runx2 mRNA的表達(dá)以及增加Notch1、CBF1、Jag1來促進BMSCs的骨向分化。Liu等[19]研究也發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以抑制MSCs向成脂細(xì)胞分化，下調(diào)骨組織中Notch1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(N1ICD)Jag1蛋白的表達(dá)，并抑制N1ICD對Notch2 mRNA表達(dá)，改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松。邢貞武[20]發(fā)現(xiàn)提取骨質(zhì)疏松患者的BMSCs進行離體培養(yǎng)，添加補骨脂素后，受體Notch1、配體Jag1和Hes1的表達(dá)增高，說明補骨脂素能提高BMSCs的Notch信號通路的關(guān)鍵分子表達(dá)，提示補骨脂素能通過Notch信號通路促進成骨分化，抑制成脂分化。

目前，對作用于Notch信號通路的西藥研究較少，介導(dǎo)Notch信號通路調(diào)節(jié)BMSCs分化功能的西藥研究尚未報道，而中藥調(diào)節(jié)Notch信號通路僅僅是對通路上重要靶基因和關(guān)鍵蛋白進行研究，其具體機制尚不明確，還有待于進一步研究。

2.2 外源性因子介導(dǎo)Notch信號通路對BMSCs的影響

外源性因子可以介導(dǎo)Notch信號通路誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，對骨代謝維持平衡具有重要意義。Diaz-Tocados等[21]通過實驗觀察發(fā)現(xiàn)，氯化鎂能夠通過Notch信號傳導(dǎo)激活BMSCs擴增，促進成骨細(xì)胞成熟。王維東等[22]研究發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)基因敲除的小鼠其Notch信號通路上的受體Notch1和配體Jag1表達(dá)低于野生小鼠，提示內(nèi)源性PTH缺失可能通過降低Notch信號通路受體和配體的表達(dá)來抑制BMSCs的骨向分化。范金柱等[23]發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性與健康女性相比，BMSCs中Notch信號通路減弱，給予患者補充雌激素后，Notch信號通路恢復(fù)活性，受體Notch1、配體Jag1表達(dá)升高，通路下游分子Hes1也表達(dá)上升，提示雌激素能促進BMSCs向成骨分化，Notch信號通路可能成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的新靶點。徐瑩等[24]對培養(yǎng)的BMSCs給予糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GCs)處理后發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的靶基因Hes1表達(dá)降低，提示GCs可以通過抑制Notch信號通路表達(dá)抑制BMSCs成骨分化。鄭介柏等[25]發(fā)現(xiàn)γ分泌酶特異性抑制劑DAPT(γ-secretase inhibitor)能夠阻斷Notch信號通路活化，抑制BMSCs的增殖，同時Notch信號通路活化抑制后，ALP活性增強，BMSCs骨向分化能力增強。

外源性的因子通過調(diào)節(jié)Notch信號通路的關(guān)鍵受體和配體，影響B(tài)MSCs的分化功能，涉及到激素、金屬離子，但是研究較少，其具體機制仍有待進一步闡述。

2.3 機械刺激介導(dǎo)Notch信號通路對BMSCs的影響

機械刺激調(diào)節(jié)Notch信號傳導(dǎo)并影響細(xì)胞的活動。Manokawinchoke等[26]對小鼠前成骨細(xì)胞系干預(yù)發(fā)現(xiàn)，間歇性壓應(yīng)力上調(diào)Notch信號傳導(dǎo)的靶基因表達(dá)，誘導(dǎo)的Hes1、Hey1 mRNA可被DAPT抑制，這一實驗提示Notch信號參與了骨細(xì)胞在機械應(yīng)激刺激下的穩(wěn)態(tài)維持。張鵬等[27]使用基因芯片技術(shù)檢測到Notch信號通路中的Jag1在應(yīng)力組明顯上調(diào)，可能是Notch信號通路被早期激活，參與BMSC成骨分化過程。Tanabe等[28]研究發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白在壓力刺激下降低，而骨膜蛋白(Periostin)能夠與Notch1前體結(jié)合，維持Notch1在壓力刺激下的信號傳導(dǎo)。劉玉林等[29]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在低聲壓次聲的干預(yù)下Jag1、Notch1、Hes1 基因及蛋白表達(dá)顯著增加，激活Notch信號通路。Ziouti等[30]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)拉伸BMSCs后通過生物反應(yīng)器系統(tǒng)檢測到Notch靶基因的表達(dá)上調(diào)，進一步研究證明Notch信號控制BMSCs中機械反應(yīng)基因的表達(dá)，其中Notch2是介導(dǎo)Notch信號對BMSCs作用的關(guān)鍵受體。在機械刺激下，BMSCs向成骨分化的生物特性會發(fā)生相應(yīng)改變，Notch信號傳導(dǎo)中的受體和配體也會受到影響。

3 Notch信號通路在骨代謝相關(guān)疾病中的功能作用

3.1 Notch信號通路與Alagille綜合征

Alagille綜合征(Alagille syndrome，ALGS)是一種多系統(tǒng)受損的遺傳疾病， 33%～87%的患者出現(xiàn)骨骼異常，表現(xiàn)為椎骨異常(蝴蝶椎骨)或矢狀裂，受影響的椎骨椎體分裂，形成成對的半椎骨，在影像學(xué)中表現(xiàn)為“蝴蝶”特征的外觀[31]。同時患者還可能出現(xiàn)身材矮小、骨質(zhì)疏松等表現(xiàn)[32]。Notch信號通路中的Jag1和Notch2基因突變可能是造成Alagille綜合征的原因之一。在94%～96%的病例中可檢測到Jag1基因出現(xiàn)變異，1%～2%的病例中檢測到Notch2基因突變[33-34]。

3.2 Notch信號通路與Adams Oliver綜合征

Adams Oliver綜合征(Adams Oliver syndrome，AOS)是一種罕見的先天性疾病，其特征是先天性發(fā)育不全和末端橫向肢體缺陷，該疾病與6種遺傳基因突變相關(guān)(ARH-GAP31、DLL4、Notch1、RBPJ、DOCK6、EOGT)[35]，Notch1、DLL4和RBPJ基因編碼的蛋白質(zhì)是Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分。其中，Notch1和DLL4蛋白對血管發(fā)育至關(guān)重要，Notch1突變主要與肢體缺陷有關(guān)，表現(xiàn)為肢體指體缺失或畸形，患者手指或腳趾可能表現(xiàn)為融合、過短或缺失[36]。

3.3 Notch信號通路與脊椎肋骨發(fā)育不良

脊椎肋骨發(fā)育不良是一種罕見疾病，其特征是椎體分割缺陷和繼發(fā)缺陷性椎體形成的肋骨異常，表現(xiàn)為頸部短而僵硬和軀干較短[37-38]。Notch信號通路的功能之一是在早期發(fā)育過程中調(diào)節(jié)椎骨和肋骨分開，即體節(jié)分割。當(dāng)Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被破壞時，體節(jié)分割不能正常發(fā)生，導(dǎo)致椎骨、肋骨的畸形和融合[39]。這種疾病產(chǎn)生可能是DLL3突變造成Notch配體截斷或折疊錯誤的蛋白翻譯[40]。

3.4 Notch信號通路與Hajdu-Cheney綜合征

Hajdu-Cheney綜合征(Hajdu-Cheney syndrome，HCS)是一種罕見的遺傳性疾病，也稱為遺傳性骨發(fā)育不良并肢端溶骨癥，其特征為手和腳的骨質(zhì)疏松癥以及骨骼、牙齒和關(guān)節(jié)的發(fā)育缺陷，導(dǎo)致特殊的顱面和顱骨改變，骨質(zhì)疏松癥和身材矮小。Notch 2的外顯子區(qū)域缺失或發(fā)生無義突變，導(dǎo)致含脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域缺乏蛋白質(zhì)產(chǎn)物[41]。突變導(dǎo)致截短的穩(wěn)定Notch2蛋白的形成和Notch2在信號傳導(dǎo)中增強。顱面和心血管發(fā)育異常的病理機制可能與Notch對骨骼和心臟發(fā)育的影響有關(guān)，身材矮小可能繼發(fā)于Notch對軟骨形成的抑制作用，但具體的發(fā)病機制尚未闡明。

3.5 Notch信號通路與骨折愈合

骨折愈合是一個復(fù)雜的再生過程，骨折后會產(chǎn)生結(jié)締組織和新骨。當(dāng)骨折機械穩(wěn)定時，骨折愈合通過膜內(nèi)骨形成，當(dāng)骨不穩(wěn)定時由軟骨內(nèi)骨化[42]。在骨折愈合早期的骨膜中，Notch受體Notch1-4、配體Jag2和靶基因HES1、HEY1的表達(dá)受到抑制[43]，又有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過5、10、20 d愈合的小鼠脛骨組織中，Notch受體、配體和靶基因上調(diào)，主要是由于Notch信號傳導(dǎo)可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與骨血管生成，在骨生成過程中表達(dá)更高以增強骨修復(fù)[44]。由于Notch對骨生成和軟骨形成具有抑制作用，Notch信號的下調(diào)可能是骨折愈合過程發(fā)生的必要條件，使用在MSH同源框1啟動子控制下表達(dá)的顯性陰性MAML1來抑制Notch轉(zhuǎn)錄激活的研究表明，Notch信號傳導(dǎo)是成功骨折愈合所必需的[45]。

綜上所述，Notch信號通路對BMSCs的命運有重要的影響，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和功能。在未成熟的成骨細(xì)胞中，Notch可以抑制成骨細(xì)胞成熟及分化；在成熟的成骨細(xì)胞中，Notch抑制其分化。這也使Notch信號通路近年來成為骨重建研究中的熱點。

Notch信號通路與先天性骨代謝疾病密切相關(guān)，也說明其在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要功能。通過梳理目前BMSCs中Notch信號通路的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)外源性藥物或性因子與機械載荷可以介導(dǎo)Notch信號通路調(diào)節(jié)BMSCs的多種分化功能，從而調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育。Notch信號通路異常時會影響骨骼發(fā)育，這成為多種骨代謝疾病可能的病理機制之一。