張明煥 毛文 劉雷 祁福 李北 鄭一舟

湖北省武漢市第三醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430071

骨關(guān)節(jié)炎是一種嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的退行性疾病，其以關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞為特點(diǎn)[1]。研究[2]表明，致炎因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要原因之一。miRNA是存在于人體中的重要調(diào)節(jié)因子，其幾乎在人類的所有組織和器官中均有表達(dá)，參與細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育等生理過程[3]。研究[4]顯示，miRNA異常表達(dá)與疾病的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，人為的靶向調(diào)控miRNA的表達(dá)可能是有效防治疾病的重要手段。miR-92a-3p作為miRNA成員，參與影響多種細(xì)胞的生理和病理轉(zhuǎn)化過程，比如腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生[5-7]。以往研究[8]證實(shí)，miR-92a-3p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)下調(diào)。miRNA發(fā)揮生物學(xué)作用與靶向影響下游基因的表達(dá)有關(guān)。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)與miR-92a-3p可能互為靶向關(guān)系。EZH2是一個(gè)在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)水平異常升高的調(diào)控基因，影響軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解酶合成[9]?，F(xiàn)階段對于miR-92a-3p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)降解酶中的作用還不明確。本研究以人骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對象，用誘導(dǎo)因子IL-1β體外構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型，探討miR-92a-3p對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)降解酶的影響和機(jī)制，以期為靶向基因治療骨關(guān)節(jié)炎提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

收集湖北省武漢市第三醫(yī)院髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(非骨關(guān)節(jié)炎患者)中切除的關(guān)節(jié)軟骨組織共5例，標(biāo)本采集經(jīng)過患者和家屬知情同意。pCDNA3.1和pCDNA3.1-EZH2由湖南普拉特澤生物科技有限公司構(gòu)建；COLⅡ抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；MicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國Thermo；miR-92a-3p mimics、mimics control由南京博恩生物技術(shù)有限公司構(gòu)建合成；MMP-13抗體、MMP-1抗體購自美國Abcam；引物由北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司合成；EZH2抗體購自艾美捷科技有限公司。

1.2 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

采用單層細(xì)胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，步驟參照文獻(xiàn)[10]，取軟骨組織，浸泡到PBS溶液中，然后添加2.5 g/L的胰蛋白酶消化約15 min。將關(guān)節(jié)軟骨周圍的多余組織去除，然后用PBS再次洗滌，剪碎成1 mm3的組織塊，添加消化液(含有20%血清、0.2% Ⅱ型膠原酶)，消化20 h以后，收集細(xì)胞懸浮液，以150目的濾網(wǎng)將細(xì)胞過濾，1 500g離心10 min。添加含有10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，2 d后換液。細(xì)胞經(jīng)過Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定為軟骨細(xì)胞。

1.3 RT-PCR檢測IL-1β處理對軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)影響

收集軟骨細(xì)胞，用含IL-1β濃度為0、10 ng/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為Normal、IL-1β組，48 h以后收集細(xì)胞用RT-PCR方法檢測。步驟為：用試劑盒提取細(xì)胞中的RNA(Trizol法)，使用特異性的頸環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA合成用MicroRNA Reverse Transcription Kit。用SYBR Premix EX Taq進(jìn)行RT-PCR檢測，內(nèi)參為U6。根據(jù)反應(yīng)的Ct值對miR-92a-3p表達(dá)水平進(jìn)行定量，計(jì)算方法為2-△△Ct法。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，一共40個(gè)循環(huán)。引物序列為：U6- Sense：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，Antisense：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-92a-3p-Sense：5’-GGGGCAGTTATTGCACTTGTC-3’，Antisense：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和過表達(dá)效果檢測

在人軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimics和mimics control，轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，將轉(zhuǎn)染以后的細(xì)胞用含有IL-1β濃度為10 ng/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為miR-92a-3p+IL-1β和miR-NC+IL-1β組，把沒有轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞用含有IL-1β濃度為10 ng/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為IL-1β組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，用RT-PCR方法測定細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)變化，步驟同上。

1.5 Western blot檢測MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達(dá)

收集培養(yǎng)48 h以后的Normal、IL-1β、miR-NC+IL-1β、miR-92a-3p+IL-1β組細(xì)胞，添加RIPA蛋白裂解試劑，放在冰上裂解，細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集并轉(zhuǎn)移至離心管中，10 000g離心15 min，吸取上清，Bradford法檢測蛋白濃度。蛋白樣品中添加等體積的上樣緩沖液，置于100 ℃中孵育5 min。本研究用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，在濃縮膠中采用90 V電壓電泳，在分離膠中采用120 V電壓電泳，蛋白上樣量為40 μg。觀察溴酚藍(lán)染料電泳到凝膠的底部以后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。取PVDF膜，設(shè)置60 V電壓將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h；然后將PVDF膜放在TBST中洗滌3次，再置于1∶800稀釋以后的一抗溶液中充分結(jié)合；再次用TBST洗滌3次，最后把PVDF膜放在1∶2 000稀釋的二抗溶液中充分結(jié)合?？贵w以封閉液稀釋。按照ECL方法顯色。內(nèi)參為β-actin。根據(jù)條帶的吸光度值分析目的蛋白表達(dá)變化。

1.6 miR-92a-3p靶基因預(yù)測和鑒定

Targetscan在線靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)EZH2可能為miR-92a-3p的靶基因，EZH2的3，UTR端存在與miR-92a-3p結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體(由上海正茂生物科技有限公司構(gòu)建)。將WT、MUT分別同miR-92a-3p mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以后，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定熒光素酶變化。同時(shí)收集培養(yǎng)48 h以后的Normal、IL-1β、miR-NC+IL-1β、miR-92a-3p+IL-1β組細(xì)胞，用Western blot方法測定EZH2蛋白表達(dá)變化，步驟同上。

1.7 檢測pCDNA3.1-EZH2對過表達(dá)miR-92a-3p影響細(xì)胞MMP-13、MMP-1、COLⅡ表達(dá)的作用

將miR-92a-3p mimics、pCDNA3.1和miR-92a-3p mimics、pCDNA3.1-EZH2分別共轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞中，并用含有IL-1β濃度為10 ng/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為miR-92a-3p+ pCDNA3.1+IL-1β、miR-92a-3p+ pCDNA3.1-EZH2+IL-1β組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，用Western blot方法檢測細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)變化，步驟同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 IL-1β對軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)影響

如表1，IL-1β處理以后的軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。IL-1β可以抑制軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)。

圖1 Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定軟骨細(xì)胞Fig.1 Identification of chondrocytes with col II immunohistochemistry

表1 IL-1β處理后軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平

2.2 miR-92a-3p mimics對IL-1β條件下軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)影響

如表2，miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞中的miR-92a-3p表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。miR-92a-3p mimics提高IL-1β條件下軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平。

表2 miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平

2.3 過表達(dá)miR-92a-3p對IL-1β條件下軟骨細(xì)胞MMP-13、MMP-1、COLⅡ表達(dá)影響

如圖2和表3，IL-1β處理以后的軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1表達(dá)水平升高，COLⅡ表達(dá)水平下降(P<0.05)；miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染可以明顯減少IL-1β條件下軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1蛋白表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞中COLⅡ蛋白表達(dá)(P<0.05)。

圖2 Western blot法檢測miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達(dá)變化Fig.2 Protein expressions of MMP-13, MMP-1, and col Ⅱ in chondrocytes with the condition of IL-1β after transfection of miR-92a-3p mimics

表3 miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達(dá)水平

2.4 miR-92a-3p靶向關(guān)系預(yù)測和鑒定

如圖3和表4，在線靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)EZH2的3’UTR端與miR-92a-3p有堿基互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且EZH2-WT轉(zhuǎn)染可以降低細(xì)胞熒光素酶活性。miR-92a-3p和EZH2互為靶向關(guān)系。

2.5 過表達(dá)miR-92a-3p對IL-1β條件下軟骨細(xì)胞EZH2表達(dá)影響

如圖4和表5，IL-1β處理以后的軟骨細(xì)胞中EZH2表達(dá)水平升高(P<0.05)；miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染可以明顯減少IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)(P<0.05)。miR-92a-3p靶向負(fù)調(diào)控EZH2。

圖3 在線靶基因預(yù)測結(jié)果示意圖Fig.3 Illustrating chart of on-line target gene prediction

表4 細(xì)胞熒光素酶活性Table 4 Activity of luciferase report

圖4 Western blot法檢測miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)變化Fig.4 Protein expression of EZH2 in chondrocytes with the condition of IL-1β after transfection of miR-92a-3p mimics

2.6 pCDNA3.1-EZH2對過表達(dá)miR-92a-3p影響軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ、EZH2蛋白表達(dá)的作用

如圖5和表6，與pCDNA3.1、miR-92a-3p mimics共轉(zhuǎn)染比較，pCDNA3.1-EZH2、miR-92a-3p mimics共轉(zhuǎn)染可以提高IL-1β條件下軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1、EZH2蛋白表達(dá)水平，減少細(xì)胞中COLⅡ蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。pCDNA3.1-EZH2可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-92a-3p對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表達(dá)的影響。

表5 miR-92a-3p mimics轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)水平

圖5 Western blot法檢測miR-92a-3p mimics和pCDNA3.1-EZH2共轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)變化Fig.5 Protein expression of EZH2 in chondrocytes with the condition of IL-1β after co- transfection of miR-92a-3p mimics and pCDNA3.1-EZH2

表6 miR-92a-3p mimics和pCDNA3.1-EZH2共轉(zhuǎn)染后經(jīng)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ、EZH2蛋白表達(dá)水平

3 討論

IL-1β是一個(gè)促炎因子，其是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要誘因。IL-1β可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)降解酶，加快細(xì)胞外基質(zhì)降解[11]。正常情況下，骨關(guān)節(jié)軟骨組織中存在的膠原蛋白可以起到保護(hù)關(guān)節(jié)的作用，而骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)，膠原蛋白被降解，造成軟骨組織破壞[12]。COLⅡ是一種膠原蛋白，其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)水平明顯下降[13]。MMPs是一類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，其含有多個(gè)成員，在人體不同的組織中表達(dá)，軟骨細(xì)胞合成的MMPs能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)降解，破壞結(jié)締組織，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[14]。研究顯示，MMP-13和MMP-1均是MMPs家族中與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系最為密切的蛋白成員，其表達(dá)水平越高，骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度越高[15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1β處理以后的軟骨細(xì)胞中MMP-13和MMP-1表達(dá)水平升高，而COLⅡ表達(dá)水平降低，提示成功構(gòu)建了骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞體外模型。

miRNA是一類缺乏開放閱讀框的小分子RNA，其不具備編碼蛋白質(zhì)的功能。miRNA在人體多種組織中表達(dá)，參與不同的生理過程，在細(xì)胞分化、能量代謝、神經(jīng)發(fā)育等過程中發(fā)揮作用[16]。研究表明，miRNA與疾病發(fā)生有關(guān)，在疾病進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用。miR-92a-3p在人體中廣泛表達(dá)，與腫瘤、冠心病等有關(guān)[5,17]。研究報(bào)道顯示，miR-92a-3p參與調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育以及穩(wěn)態(tài)維持過程，并且miR-92a-3p可能與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)，其在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)下調(diào)[8]。我們的研究結(jié)果表明，IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miR-92a-3p表達(dá)水平下降，過表達(dá)miR-92a-3p可以明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞合成MMP-13和MMP-1，同時(shí)促進(jìn)COLⅡ表達(dá)，這提示miR-92a-3p能夠減少骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)降解酶，miR-92a-3p在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

miRNA作用多樣，其作用機(jī)制也十分復(fù)雜，miRNA通過影響下游基因的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)作用[18-19]。研究表明，miRNA靶基因調(diào)控是miRNA功能發(fā)揮的重要原因之一，并且同一個(gè)miRNA在不同的組織或生理進(jìn)程中可能同時(shí)存在多個(gè)靶基因[20]。本研究表明，miR-92a-3p可以靶向調(diào)控軟骨細(xì)胞中EZH2的表達(dá)。EZH2基因定位在7q35染色體上，其含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，具有染色體修飾功能[21-22]。EZH2參與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，在人關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)上調(diào)，而抑制EZH2可以減少關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)降解酶，EZH2抑制劑可以減緩小鼠骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[9]。我們的研究表明，EZH2可以逆轉(zhuǎn)miR-92a-3p對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞合成MMP-13、MMP-1和COLⅡ的影響，提示miR-92a-3p作用機(jī)制與靶向影響EZH2表達(dá)有關(guān)。

總之，miR-92a-3p在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中可能發(fā)揮抑制作用，其在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-92a-3p可以減少軟骨細(xì)胞合成MMP-13、MMP-1并促進(jìn)細(xì)胞合成COLⅡ，作用機(jī)制與靶向負(fù)調(diào)控EZH2有關(guān)。以后會繼續(xù)研究miR-92a-3p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解酶合成中的下游網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。本研究果為研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生機(jī)制提供了參考，為靶向基因治療骨關(guān)節(jié)炎提供了方向。