李盡文，宋代博，李苑華，麥鍵城，劉詠倩，李 莉

(廣東醫(yī)科大學藥學院科研平臺服務管理中心，廣東 東莞 523808)

隨著經濟社會的不斷發(fā)展，人口老齡化的不斷加劇，惡性腫瘤已經成為危害人類生命健康的主要原因之一[1]。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中居第一位，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。主要原因是由于HPV感染，其次可能的原因包括性生活過早、多個性伴侶、多孕多產；外在因素例如抽煙、喝酒、熬夜等不良生活習慣；高脂肪、高熱量食品的過多攝入等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。傳統(tǒng)的癌癥治療方案包括：放療、化療和手術治療，但是放化療殺死癌細胞的同時，對人體正常細胞也會造成不可逆轉的影響，會帶來如骨髓抑制、脫發(fā)等不良反應；手術治療切除病灶會同時切除腫瘤周圍部分正常的組織，而且有淋巴轉移者預后差。因此急需尋找新的有效且毒副作用小的治療方式來抵抗癌癥。

伴隨著中醫(yī)中藥近年來的發(fā)展，中藥抵抗癌癥的作用也不斷被發(fā)掘，天然產物在治療癌癥過程中具有療效好、低毒性、藥源廣等優(yōu)勢。地黃是中藥方中一種常用的藥物，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效[3]。梓醇(catalpol)是地黃根的主要活性成分，屬于環(huán)烯醚萜類化合物?，F(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎[4]、改善腦缺血[5]、抗阿爾茨海默癥[6]、抗糖尿病[7]等作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)梓醇具有良好的抗腫瘤活性，如抗卵巢癌[8]、肝癌[9]、非小細胞肺癌[10]等等。本文擬配制不同濃度的梓醇溶液，以宮頸癌HeLa細胞為研究對象，探究其對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響。

1 實驗材料與處理分組

1.1 實驗材料

人宮頸癌HeLa細胞株(南京科佰生物科技有限公司)；梓醇catalpol(上海源葉生物科技有限公司)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青鏈霉素雙抗(solarbio)；PBS(solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液(solarbio)；MTT(BioFrox)；DMSO(solarbio)；Hoechst33342(南京碧云天生物公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將HeLa細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)設備為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，平均每兩天給細胞更換一次培養(yǎng)液，細胞長至80%左右用0.25%的胰蛋白酶對細胞進行消化傳代處理，待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

1.3 梯度濃度梓醇溶液的配制

稱取3.62 mg的梓醇標準品粉末加入1 mL的DMEM培養(yǎng)液，配成濃度為10 mmol/L的梓醇溶液，再按照實驗要求依次將其稀釋到終濃度為0.25、0.5、1 mmol/L的梓醇溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 實驗分組處理

取對數(shù)生長期的HeLa細胞，調整細胞數(shù)為3×104個/mL，將細胞接種于96孔板中，待細胞經孵箱孵育至貼壁生長后，吸出原培養(yǎng)液。實驗分組為：空白對照組(control)，加入完全培養(yǎng)基；梓醇高劑量處理組、梓醇中劑量處理組、梓醇低劑量處理組，每組設5個復孔。加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，進行后續(xù)檢測。將細胞接種于12孔板中，設空白對照組、梓醇高、中、低處理組，每組設3個復孔，不同處理24 h利用倒置顯微鏡鏡下觀察細胞形態(tài)的變化以及Hoechst核染檢測細胞細胞凋亡。

2 實驗方法

2.1 MTT細胞增殖檢測

細胞經高、中、低濃度梓醇溶液處理(24、48 h)后，吸去培養(yǎng)液，每孔用PBS潤洗1～2次，避免殘留的藥物與MTT反應而影響實驗結果，然后每孔加入100 μL含 10% MTT (5 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。2～4 h吸去MTT溶液，每孔加100 μL DMSO后放入脫色搖床脫色10 min，置于酶標儀中測定孔中細胞的OD值，檢測波長為490 nm。計算各組平均存活率并繪制細胞生長曲線。設置空白對照組的細胞存活率為100%，按公式計算各組細胞存活率：細胞存活率=實驗組平均OD值/對照組平均OD值×100%

2.2 細胞形態(tài)檢測

細胞經過不同濃度梓醇處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔用PBS潤洗1～2次，洗完孔內留少量PBS溶液。隨即用倒置顯微鏡觀察不同處理組細胞的形態(tài)變化。

2.3 Hoechst33342核染鏡下細胞凋亡觀察

細胞經過不同濃度梓醇處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔用PBS潤洗1～2次，洗完孔內留少量PBS溶液。每孔加入200 μL Hoechst33342溶液，避光孵育5～10 min，孵育結束后吸除Hoechst 33342染色液，用PBS洗滌2～3次，每次3～5 min，洗滌完留少許PBS在孔內，然后直接在熒光顯微鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，用GraphPad Prism 8.0軟件分析，所有實驗結果均重復三次以上，結果采用單因素方差分析和t-test進行分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 梓醇抑制宮頸癌HeLa細胞增殖

梓醇的結構如圖1。為明確梓醇抗宮頸癌HeLa細胞的增殖效果，實驗采用高、中、低不同濃度的梓醇以及空白對照處理HeLa細胞24、48 h，用MTT實驗檢測不同濃度藥物處理后HeLa細胞的吸光度。如圖2所示，經梓醇處理的細胞存活率明顯降低，與空白對照組相比梓醇以時間和劑量依賴性抑制HeLa細胞的增殖。

(A)2D結構，(B)3D結構

圖2 梓醇對HeLa細胞增殖的影響

3.2 梓醇誘導HeLa細胞形態(tài)改變

不同濃度的梓醇溶液處理細胞后，顯微鏡下觀察到隨著梓醇濃度的增加，HeLa細胞數(shù)目逐漸減少，細胞開始收縮，核膜裂解并出現(xiàn)核固縮等凋亡形態(tài)變化，如圖3所示。

圖3 梓醇對細胞形態(tài)的影響

3.3 梓醇誘導HeLa細胞凋亡小體的產生

用Hoechst33342染液對不同濃度梓醇處理24 h的HeLa細胞進行染色，如圖4所示，在熒光顯微鏡下梓醇高、中、低處理組均可明顯觀察到細胞核呈濃染致密的顆粒塊狀熒光，顯示有凋亡小體的形成。實驗表明，與對照組相比，梓醇能夠誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡。

圖4 梓醇對細胞凋亡的影響

4 討論

通常認為腫瘤的發(fā)生是由于癌細胞不受調控、無限增殖，腫瘤細胞中抑癌基因被抑制，而癌基因和原癌基因則被激活處于過表達狀態(tài)，這些基因的變化和腫瘤的發(fā)生密不可分。細胞凋亡是機體為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞發(fā)生的程序性死亡。它受到嚴格的調控，涉及到一系列基因的激活或抑制、蛋白差異表達與相互作用以及信號通路的改變。細胞凋亡與腫瘤的關系同樣密切，腫瘤細胞的凋亡機制不能正常運行，導致腫瘤無法通過凋亡路徑被清除。因此通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡對于藥物發(fā)揮抗腫瘤作用具有十分重要的意義。Yan[11]等研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈下調Cbl-b誘導乳腺癌細胞凋亡達到抗腫瘤的作用；Gao等[12]的研究表明雷公藤甲素能夠上調 Bax同時下調 Bcl-2 的表達，從而誘導乳腺癌 MCF-7 細胞凋亡；馮[13]等人研究發(fā)現(xiàn)半夏提取物能有效抑制白血病細胞增殖并促進其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠明顯抑制宮頸癌HeLa細胞增殖并誘導其發(fā)生凋亡，從而在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。

5 結論與展望

綜上所述，梓醇作為一種中藥單體化合物，能夠以時間和劑量依賴性來抑制宮頸癌細胞的增殖，并且通過誘導HeLa細胞凋亡而殺滅腫瘤細胞，從而實現(xiàn)抵抗癌癥的作用。實驗為梓醇抗腫瘤的藥理作用提供一定的理論依據(jù)和研究基礎，但是其抗腫瘤作用分子機制以及體內抗腫瘤的作用尚未可知，需待進一步研究探索。