馮培祥，楊 莉，莊桂玉，趙付偉，嵇傳良，王延濤，姜桂苗

(1. 國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心 東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252200；2. 青島西海岸新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266400)

腹瀉是引起驢駒死亡的最常見原因之一，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。據(jù)報(bào)道[3-4]，在驢駒6月齡前，多達(dá)20%驢駒腹瀉是由傳染性病原引起的，引起驢駒腹瀉病因復(fù)雜，涉及到傳染源、飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)及環(huán)境、生理?xiàng)l件等多方面因素。而引起驢腹瀉病主要病原菌之一是大腸桿菌。大腸桿菌作為動(dòng)物腸道共棲菌[5]和條件致病菌，在臨床上，其引起幼畜腹瀉，嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥的臨床癥狀[6-7]。近年來，隨著驢養(yǎng)殖數(shù)量增加，因腹瀉問題導(dǎo)致幼駒發(fā)病率及死亡率不斷升高，給養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)造成的損失較大。2017年7月份，聊城某規(guī)模驢場暴發(fā)了驢駒腹瀉病，其發(fā)病率約為31%，死亡率約為17%。筆者通過剖檢、無菌采集死亡驢駒組織樣品，實(shí)驗(yàn)室分離鑒定為大腸桿菌。通過藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，為該病在臨床上的選擇用藥提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2018年7月份，剖檢采集聊城某養(yǎng)驢場2頭2月齡死于腹瀉驢駒的肝、脾、肺、腸道等臟器，置于4 ℃ 保存，在6 h 內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌接種培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 PremixTaqTM、pMD19-T載體、DL-2 000 DNA Marker、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，均購自寶生物工程(大連)有限公司。麥康凱培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基及MH培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 藥物 青霉素、丁胺卡那霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星等14種藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要設(shè)備 上海博訊恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HPX-9272MBE)、Touch PCR基因擴(kuò)增儀(960)、山東鑫科生物科技股份有限公司自動(dòng)生化/藥敏分析儀(XK型)、北京君意垂直電泳儀(JY300C)、上海安亭高速離心機(jī)(TGL-16G)、山東鑫科比濁儀(XK型)。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離及特性培養(yǎng) 通過分區(qū)劃線將驢駒肝、脾、肺及腸管病料分別接種普通瓊脂、伊紅美藍(lán)、麥康凱3種平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h 后觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

為排查臟器是否存在病毒感染，參考文獻(xiàn)[8]的方法，將上述臟器稱重研磨，制成加入PBS的1∶5(W/V)懸液，將雙抗(100×)加入，之后反復(fù)凍融 3～4次，將過濾的上清液接種至犢牛睪丸細(xì)胞，37 ℃ 培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞染色后于電鏡下觀察有無病變。

1.2.2 分離菌生化鑒定 參照山東鑫科生物科技股份有限公司細(xì)菌生化鑒定試劑盒(XK-24A-C)說明書進(jìn)行操作，通過生化儀(XK型)進(jìn)行鑒定并判讀結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 參照CLSL推薦的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[9]，觀察藥敏紙片周圍有無抑菌圈形成，測量其直徑(d)大小。將2株分離菌藥敏試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)平行。參考羅玲等[10]報(bào)道方法進(jìn)行結(jié)果判定：d>15 mm 為高度敏感；10.1 mm

1.2.4 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用苯酚-氯仿法提取2株分離菌DNA。參考鐘世勛等[11]設(shè)計(jì)16S rRNA上游引物F：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，下游引物R：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增陽性產(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將重組陽性質(zhì)粒命名為E1、E2，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將分離菌E1、E2的16S rRNA序列通過NCBI的Blast進(jìn)行同源性比對，使用DNASTAR軟件從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得其他大腸桿菌16S rRNA 序列進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，采用鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 分離菌培養(yǎng)特征及形態(tài)觀察 從腹瀉驢駒肺臟及腸管內(nèi)分離到E1、E2兩株細(xì)菌，其他臟器均未分離到細(xì)菌。2株分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上可見表面光滑、半透明的單菌落。其在麥康凱瓊脂平板上形成圓形、邊緣整齊的紅色單個(gè)或多個(gè)菌落。在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基長出帶金屬光澤、深紫黑色的圓形菌落。2株分離菌革蘭染色為陰性，鏡檢可見其為兩端鈍圓的短桿菌，散在排列。

處理臟器的懸液接種犢牛睪丸細(xì)胞后，無病變出現(xiàn)，通過鏡檢未見病毒顆粒。

2.2 分離菌的生化鑒定 分離菌E1、E2的生化反應(yīng)結(jié)果一致，均符合大腸桿菌生化特性。

2.3 藥敏試驗(yàn) 測量分離菌E1、E2的抑菌圈直徑結(jié)果顯示，2株分離菌的藥物敏感性相似，取其平均值，結(jié)果見表1。

表1 2株分離株的藥物敏感性(平均值)Table 1 Drug sensitivity of 2 isolates (Average)

2.4 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)進(jìn)化分析 擴(kuò)增E1、E2 16S rRNA后，在1 500 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖1)。將E1、E2的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，其結(jié)果與大腸肝菌的16S rRNA 基因自然聚類，將分離株分別與 GenBank收錄的大腸桿菌通過DNASTAR進(jìn)行同源性分析，并繪制成系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示，2株分離株核苷酸序列之間的同源性為98.9%，與GenBank收錄的其他大腸桿菌同源性在97.6%～99.8%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖3所示，2株分離菌處于同一分支，且與牦牛源大腸桿菌JN180964.1最近，最終構(gòu)成一個(gè)分支。

圖1 2株分離菌16S rRNA目的基因的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of 16S rRNA target genes of two isolates1:陰性對照； 2:E1； 3:E2； M:DL-2 000 Marker1:Negative control; 2:E1; 3:E2; M:DL-2 000 Marker

圖2 2株分離菌16S rRNA基因序列的同源性Fig.2 The homology of 16S rRNA gene sequence of two isolates

圖3 分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of isolates

3 討論

本試驗(yàn)從腹瀉驢駒的肺臟和腸管內(nèi)分離到2株大腸桿菌E1、E2，分離株E1、E2與大腸桿菌的同源性最高為99.8%。除采用傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法外，本試驗(yàn)選取了16S rRNA基因擴(kuò)增測序法對未知菌落進(jìn)行了鑒定。因16S rRNA基因在細(xì)菌中具備高度保守序列，具有細(xì)菌種、屬特征，已被用作細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類的目的基因，是一種對細(xì)菌分類鑒定快速、準(zhǔn)確的方法[12]。據(jù)高靜雯等[13]報(bào)道，從患乳房炎驢的乳汁中分離鑒定出大腸桿菌，其耐藥性較差，對青霉素、阿莫西林、慶大霉素等藥物都敏感。據(jù)孫瑩慧等[14]報(bào)道，其從腹瀉驢駒脾臟組織內(nèi)分離到1株大腸桿菌，對22種藥物都有耐藥性，僅對多黏菌素敏感，提示該養(yǎng)殖場大腸桿菌分離株耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，需要在用藥方面引起管理者的重視。

細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生原因是多方面的，除了細(xì)菌本身內(nèi)在特性外，還與抗生素不合理應(yīng)用有極大關(guān)系[15]。結(jié)合該驢場用藥史及現(xiàn)場的飼養(yǎng)管理情況，提示該場暴發(fā)驢駒腹瀉主要原因是濫用抗生素，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生，誘因是飼養(yǎng)管理較為粗放，加劇了該病的發(fā)展。因此，筆者建議驢場需從源頭上查找并解決問題，嚴(yán)格遵守獸藥用藥規(guī)范，合理用藥，提升飼養(yǎng)管理水平，做好已發(fā)病驢駒治療與護(hù)理工作，以降低驢駒發(fā)病率與死亡率。半個(gè)月后回訪，該場長告知，通過選用敏感藥物丁胺卡那霉素灌服，配合肌內(nèi)注射環(huán)丙沙星注射液，及時(shí)給脫水驢駒補(bǔ)液等處理措施，場內(nèi)驢駒腹瀉情況已經(jīng)得到控制。1個(gè)月后電話回訪，通過圈舍衛(wèi)生條件的改善及選用敏感藥物治療，驢駒腹瀉問題已可控，其發(fā)病率已降至7%，再未出現(xiàn)因腹瀉導(dǎo)致的死駒情況。由此可見，細(xì)菌引起的驢駒腹瀉問題是可控的。本試驗(yàn)為腹瀉驢駒病因查找提供了理論依據(jù)，并為驢場腹瀉驢駒篩選出了有效抗菌藥物，也為該驢場疾病防治提供了參考。