胡高爽,高 山,*,韓 雪,王 君,李 娜

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050000;2.滄州師范學院生命科學學院,河北滄州 061000;3.河北英茂生物科技有限公司,河北石家莊 050000)

羅丹明B(Rhodamine B)又名玫瑰紅B,分子式為C28H31ClN2O3,是一種人工合成的堿性熒光染料。根據(jù)國際癌癥研究署(IARC)化學品致癌風險評估表明,羅丹明B具有強烈的“三致”(致癌、致畸、致突變)風險[1-3]。國家衛(wèi)生部門在食品整治辦(2008)3號文件“關于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》的通知”中,將羅丹明B納入首批可能違法添加的非食用物質(zhì),嚴禁在食品中添加[4]。

目前針對羅丹明B檢測的方法有很多種,主要包括光譜法[5]、高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[6-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)[10-13]等。然而這些檢測方法需要昂貴的儀器設備、檢測過程繁瑣耗時較長,無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測?；诳乖?抗體特異性結(jié)合反應的免疫學方法,具有快速靈敏、特異性強,實際操作簡便等優(yōu)點[14-16],其中免疫親和凝膠檢測柱是基于免疫親和檢測法發(fā)展起來的一種可視化快速檢測方法。但是,傳統(tǒng)的免疫分析技術大多采用酶蛋白作為標記物,容易受到基質(zhì)的影響,繁瑣的樣品前處理過程阻礙了實驗方法靈敏度的提升。

近年來,熒光技術得到了國內(nèi)外科研工作者的廣泛關注,并逐漸應用于免疫分析技術中[17-19]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是一種兩個相互靠近的供體與受體通過偶極子-偶極子相互作用而產(chǎn)生的非輻射性的過程,其中熒光猝滅是熒光能量共振轉(zhuǎn)移導致現(xiàn)象之一[20-22]。本研究旨在建立一種基于量子點的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱方法,并將其應用于番茄醬中羅丹明B的快速分析檢測。該方法基于熒光供體(羧基化量子點,最大發(fā)射波長為532 nm)與熒光受體(羅丹明B,最大吸收波長為554 nm,最大的熒光波長為610 nm)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移導致熒光猝滅的現(xiàn)象,結(jié)合免疫親和凝膠檢測柱的特異性識別作用,以實現(xiàn)番茄醬中羅丹明B的快速分析檢測,可用于番茄醬中羅丹明B的現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溴化氫活化瓊脂糖凝膠-4B、甘氨酸(Glycine) 分析純,美國Sigma公司;鹽酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙酸鈉均 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;羅丹明B單克隆抗體 山東綠都生物科技有限公司;羧基化ZnCdSe/ZnS量子點(最大發(fā)射波長532 nm) 武漢珈源量子點技術開發(fā)有限公司;亨氏番茄醬樣品 當?shù)爻小?/p>

Shimadzu UV-2300紫外分光光度計 日本Shimadzu公司;F-4500熒光光譜儀 日本Hitachi公司;四用暗箱紫外分析儀 上海勤科分析儀器有限公司;高效液相色譜儀、waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅丹明B分析物抗體膠的制備 將羅丹明B抗體與溴化氫活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備羅丹明B分析物抗體膠,具體偶聯(lián)的過程如下[23-25]:1.0 g的溴化氫活化瓊脂糖凝膠與80 mL 1 mmol/L HCl溶液混合攪拌均勻并放置溶脹10 min;將溶脹好的凝膠轉(zhuǎn)移到具砂板層析柱中,穩(wěn)定后再用200 mL HCl溶液對瓊脂糖凝膠進行淋洗。取10 mL偶聯(lián)緩沖液(2.92 g NaCl,0.84 g NaHCO3,加入100 mL雙蒸水,用NaOH調(diào)pH至8.3),分三次倒入層析柱中,將瓊脂糖凝膠體系調(diào)節(jié)至中性。取適量羅丹明B單克隆抗體(4 mg/mL)用緩沖液稀釋后加入到具砂板層析柱中,室溫條件下振蕩反應2 h。反應時間結(jié)束后,再進行三次沖洗。隨后加入10 mL的甘氨酸封閉液(0.3 g甘氨酸加入到10 mL的偶聯(lián)緩沖液中)進行封閉,室溫下連續(xù)振蕩反應2 h。反應結(jié)束后,用已配好的醋酸鈉緩沖液(2.92 g NaCl,0.58 mL CH3COOH,加入100 mL雙蒸水溶解,再用無水乙酸鈉調(diào)pH至4.0)和偶聯(lián)緩沖液各10 mL依次倒入具砂板層析柱中對瓊脂糖凝膠進行沖洗,此步驟重復三次,待緩沖液全部自然流出后,抽空瓊脂糖凝膠中的清洗液,用磷酸鹽緩沖液將制備好的封閉膠懸起,放置于冰箱中4 ℃保存,以備后續(xù)實驗操作的正常使用。

1.2.2 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱的組裝和檢測 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱只由單層檢測層組成的,取一個聚乙烯墊片放入1 mL的塑料柱,然后在塑料柱中加入150 μL混勻混合的分析物抗體膠,注射器置于塑料柱上加壓將其中所帶的磷酸鹽緩沖液壓出,塑料管中剩余的濃縮分析物抗體膠即為熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱的檢測層。在檢測柱中放入第二片聚乙烯墊片,如圖1所示,將其壓至分析物抗體膠的上面,使分析物抗體膠上下分別被兩墊片固定住。在檢測柱中加入含有羅丹明B的樣品溶液,用注射器加壓,將磷酸鹽緩沖液繼續(xù)壓出,然后加入50 μL制備好的一定稀釋倍數(shù)的ZnCdSe/ZnS量子點溶液,通過注射器施加壓力使加入的量子點溶液完全侵入檢測柱分析物抗體凝膠中,即可完成羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱的組裝和檢測,通過觀察檢測層熒光強度的變化實現(xiàn)對羅丹明B的快速分析檢測。

1.2.3 實際樣品檢測 樣品前處理的方法參考先前的文獻并做了進一步的改進[26-27],取1 g番茄醬樣品,分別添加一系列濃度的羅丹明B(5.0、10.0和20.0 μg/kg),加入1 mL水,混合均勻,加入4 mL乙腈,劇烈振蕩30 s,使羅丹明B充分溶解;再加入5 mL正乙烷,劇烈振蕩5 min,除去體系中存在的脂肪等干擾;離心至上下分層明顯后,取出1 mL乙腈相并用氮氣吹干,用1 mL PBS復溶,然后用所構(gòu)建的羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱進行測定。

1.2.4 HPLC分析 為了驗證方法的實用性和準確性,參考SN/T 2430-2010 《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》中的高效液相色譜檢測方法進行驗證。稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中,準確加入25 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液(1∶1,體積比),于旋渦混勻器上混合提取2 min,再超聲提取15 min后,于4000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜后作待凈化液。HPLC分析條件:色譜柱:Waters C184.6 mm×250 mm,5 μm;激發(fā)波長:550 nm 發(fā)射波長580 nm;流動相:A(甲醇)∶B(水)4∶1 (v/v);流速1.0 mL/min,進樣體積20 μL;柱溫:35 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件和Excel 2013軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差(Means±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅丹明B量子點熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱原理

本研究基于抗原抗體特異性結(jié)合反應和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理,建立了一種針對番茄醬中非法著色劑羅丹明B進行快速檢測的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱方法,其原理如圖1所示。首先將特異性識別羅丹明B的單克隆抗體與溴化氫活化瓊脂糖凝膠-4B偶聯(lián)制備檢測柱的檢測層。當加入含有羅丹明B樣品時,羅丹明B就被抗體特異性的吸附到檢測層。再向體系中加入適量的羧基化ZnCdSe/ZnS量子點,這時由于量子點表面富含羧基,羧基為陰離子,帶有負電荷,羅丹明B是帶有正電荷的雜環(huán)堿性染料,兩者之間能夠通過靜電引力的相互作用緊密結(jié)合在一起,滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移的對距離的要求。同時ZnCdSe/ZnS量子點的最大熒光發(fā)射波長(532 nm)與羅丹明B最大吸收波長(554 nm)發(fā)生重疊,能夠滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移的光譜重疊的要求。這時量子點與羅丹明B發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,出現(xiàn)量子點(綠色熒光)熒光猝滅而羅丹明B熒光(紅色熒光)增強的現(xiàn)象。樣品中羅丹明B含量越多,與抗體特異性結(jié)合越多,在檢測層中與量子點溶液發(fā)生熒光猝滅越明顯,檢測層觀察到的量子點(綠色熒光)熒光猝滅而羅丹明B熒光(紅色熒光)增強現(xiàn)象越明顯。本研究根據(jù)檢測層中熒光亮度變化為本實驗的檢測指標,當檢測層中的綠色熒光發(fā)生明顯變化,此時對應的濃度確立為羅丹明B的檢測限。

圖1 羅丹明B量子點熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱原理圖

2.2 量子點熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱條件優(yōu)化

2.2.1 分析物抗體膠中抗體量的確定 在制備分析物抗體膠的過程中,抗體添加量過少或過多,抗原抗體的特異性結(jié)合會受到影響,結(jié)合到分析膠上的抗體越多,檢測層富集分析物的能力越強,因此在相同熒光強度下方法的靈敏度也就越高。然而,抗體添加量過多,不僅會導致實驗成本的提高,而且過多的抗體會導致凝膠上抗體蛋白分布不均或自聚集影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。因此,分析物抗體膠制備過程中抗體添加量是非常重要的因素。分別取不同量的羅丹明B單克隆抗體(0、1.0、2.0和3.0 mg)與固定量1.0 g的溴化氫活化的瓊脂糖凝膠發(fā)生偶聯(lián)反應制備檢測層,固定羅丹明B添加濃度(3.0 μg/L)、上樣體積(1.0 mL)以及量子點濃度(稀釋3000倍)等其他條件,按上述實驗方法進行樣品操作,在紫外分析儀365 nm的UV光照下,選擇導致熒光強度明顯變化的最小抗體添加量作為抗體膠中最佳抗體量。結(jié)果如圖2所示,2.0 mg羅丹明B單克隆抗體與1.0 g的瓊脂糖凝膠結(jié)合,檢測層中的綠色熒光完全消失,熒光淬滅現(xiàn)象明顯。因此,選擇2.0 mg羅丹明B單克隆抗體(每1.0 g溴化氫活化的瓊脂糖凝膠)為分析物抗體膠中抗體量的最優(yōu)值。

圖2 分析物抗體膠中抗體量的優(yōu)化

2.2.2 量子點稀釋倍數(shù)的確定 量子點稀釋倍數(shù)對檢測體系的靈敏度也有重要影響。若稀釋倍數(shù)過大,量子點濃度小則熒光亮度較低,不易觀察;若溶液稀釋倍數(shù)太小,熒光亮度過大,則熒光猝滅效應不易發(fā)生。本研究中,ZnCdSe/ZnS量子點原溶液濃度為8 μmoL/L,實驗中用磷酸鹽緩沖液將量子點溶液分別稀釋1000、2000、3000和4000倍,用優(yōu)化好的抗體膠、固定體積(1.0 mL)和固定濃度(3.0 μg/L)的羅丹明B溶液,按上述實驗方法操作,選擇能夠?qū)е聶z測層中熒光猝滅的最小稀釋倍數(shù)作為最佳稀釋倍數(shù)。在紫外分析儀365 nm的UV光照下,各個檢測柱的結(jié)果如圖3所示,當量子點溶液稀釋3000倍時檢測柱中熒光亮度發(fā)生猝滅效果最好。

圖3 量子點稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

2.2.3 孵育時間的確定 實驗中分析物與抗體孵育時間的長短直接影響抗原抗體結(jié)合與非特異性吸附程度,適當?shù)姆跤龝r間可以確保分析物和抗體之間的特異性識別和結(jié)合,減少非特異性吸附作用,從而提高檢測的靈敏度。因此,需要對反應時間進行優(yōu)化。按上述實驗方法,以1.0 mL羅丹明B(濃度為3.0 μg/L)上樣量為基準,在檢測柱中加入羅丹明B溶液并加壓使其流至檢測層時,開始計算孵育時間,時間分別控制為30、40、50、60、70 s,實驗結(jié)束后,在紫外分析儀365 nm的UV光照下觀察。結(jié)果如表1所示,當孵育時間過少時,羅丹明B與抗體反應不充分,猝滅效應不明顯,檢測層中的熒光亮度過強;當反應時間過長時,則會出現(xiàn)非特異性吸附過強的現(xiàn)象,導致檢測層中的熒光梯度變差。因此,1.0 mL羅丹明B上樣體積孵育時間控制在50 s時,反應較為充分,檢測層的綠色熒光猝滅現(xiàn)象明顯。

表1 孵育時間的確定

2.2.4 上樣體積的確定 在實驗中,對檢測柱中的羅丹明B的添加量進行優(yōu)化,確定其最佳值。對實驗中除上樣體積之外的條件進行固定,對羅丹明B(濃度為1.0 μg/L)的加入量分別控制在1.0、2.0、3.0、4.0 mL,按照上述實驗方法進行操作,在紫外分析儀365 nm的UV光照下觀察。在羅丹明B的加入量為3.0 mL的條件下,檢測層中的猝滅現(xiàn)象顯色效果明顯。若羅丹明B上樣量不足,則檢測層中與量子點的熒光猝滅反應不完全,梯度也不好,影響實驗結(jié)果的準確性;若羅丹明B上樣量過大,熒光猝滅現(xiàn)象也比較明顯,但會造成實驗成本浪費檢測梯度變差,故確定3.0 mL為羅丹明B上樣量的最優(yōu)值,結(jié)果見表2。

表2 上樣體積的確定

2.3 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱檢測限的確定

將羅丹明B溶液配制成不同的濃度梯度,分別為0、1.0、2.0、5.0 μg/L,在其他實驗因素均固定且處于最優(yōu)值的條件下,對各個濃度的羅丹明B溶液進行檢測。在檢測柱中,綠色熒光亮度發(fā)生猝滅現(xiàn)象時羅丹明B濃度最低值即為本方法針對羅丹明B的檢測限。結(jié)果如圖4所示,在羅丹明B濃度為1.0 μg/L時,檢測柱出現(xiàn)明顯的綠色熒光猝滅現(xiàn)象,即本方法針對羅丹明B的檢測限為1.0 μg/L。

圖4 羅丹明B熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱檢測限的確定

2.4 樣品分析

為了驗證方法的實用性和準確性,將所建立的基于量子點的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱與高效液相色譜方法測定的結(jié)果進行比較。結(jié)果如表3所示,兩種檢測結(jié)果顯示出較好的一致性,說明所建立的方法具有很好的實用性。此外,當用所建立的方法測定添加量小于5.0 μg/kg的樣品,檢測層沒有出現(xiàn)明顯的綠色熒光淬滅現(xiàn)象,證明該方法的樣品檢測限為5.0 μg/kg。

表3 高效液相色譜法和本研究所提出方法檢測番茄醬中羅丹明B(n=3)

3 結(jié)論

本研究利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理建立了一種針對番茄醬中羅丹明B快速檢測的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱方法。在最佳優(yōu)化實驗條件下,方法針對羅丹明B的檢測限為1.0 μg/L,樣品檢測限為5.0 μg/kg,且將所建立的方法與高效液相色譜的方法進行對比,二者具有很好的一致性。該方法檢測靈敏度高,檢測速度快,非常適用于現(xiàn)場檢測。本研究能夠為番茄醬中違禁添加物羅丹明B的快速分析檢測提供新思路。