黃挺，褚以文，黃金竹

(成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，抗生素研究與再評價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610052)

由新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCOV)引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)已正式被命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，目前對全球公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重的威脅[1-2]。雖然2019年12月COVID-19的暴發(fā)主要集中在中國武漢，但是截至2020年6月28號，該疾病已經(jīng)傳播了超過200多個國家和地區(qū)，確診病例超過1000萬，確診死亡人數(shù)超過50萬[3]。此外，強(qiáng)制性的隔離導(dǎo)致了數(shù)以千萬人的生活和工作受到了影響。如果COVID-19沒有得到有效的控制，它將給各國人民生命安全和社會發(fā)展帶來巨大的挑戰(zhàn)，并對全球經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[1-2]。

冠狀病毒含有一個被包裹在膜包膜內(nèi)的單鏈RNA基因組，病毒外膜上鑲嵌著糖蛋白刺突，使其具有冠狀外觀。雖然冠狀病毒能夠同時感染人和動物，但是對于像蝙蝠這種體內(nèi)寄居著多種冠狀病毒的動物，卻很少受到冠狀病毒的攻擊[4]。冠狀病毒主要有四類，分別為α，β，γ和δ冠狀病毒。其中β類冠狀病毒包括嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)，中東呼吸綜合征病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和COVID-19病原體SARSCoV-2。與SARS-CoV相似，SARS-CoV-2主要感染機(jī)體的下呼吸系統(tǒng)從而引起病毒性肺炎，同時也可能感染胃腸系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并導(dǎo)致多器官衰竭[5]。

迄今為止，世界各國還沒有生產(chǎn)出針對SARSCoV-2特異性抗病毒藥物。加強(qiáng)預(yù)防性SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)，對COVID-19疫情的緊急防控和長遠(yuǎn)防治具有重要的意義。本文將綜述COVID-19疫情暴發(fā)至今，國內(nèi)外已報(bào)道的SARS-CoV-2疫苗研發(fā)工作，包括全球多個科研機(jī)構(gòu)已發(fā)表的科學(xué)文獻(xiàn)和專利[6-7]。為支持研究和開發(fā)有效的COVID-19的疫苗和預(yù)防性藥物提供基礎(chǔ)的理論和實(shí)踐數(shù)據(jù)，也為疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供重要的參考信息。

1 SARS-CoV-2的基本結(jié)構(gòu)與功能

β冠狀病毒基因組能夠編碼幾種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，包括負(fù)責(zé)病毒裝配的膜蛋白(membrane protein，M)和包膜蛋白(envelop protein，E)，負(fù)責(zé)RNA合成的核衣殼蛋白(nucelocapsid protein，N)，以及在病毒感染的第一步發(fā)揮重要作用的糖基化刺突蛋白(spike protein,S)。S蛋白通過與位于宿主細(xì)胞表面膜上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受體蛋白結(jié)合，輔助SARS-CoV-2入侵宿主細(xì)胞，這種入侵過程還需要S蛋白和宿主細(xì)胞的絲氨酸蛋白酶TMPRSS211共同觸發(fā)來完成[8-9]。因?yàn)樗梢詥痈腥具^程，所以冠狀病毒S蛋白與ACE2在宿主細(xì)胞表面上的相互作用非常重要。Cryo-EM結(jié)構(gòu)分析表明，SARS-CoV-2的 S蛋白與ACE2的結(jié)合親和力比SARS-CoV 的S蛋白高約10～20倍[8,10]。所以與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2可能具有更高的傳播性和傳染性[11]。

除了結(jié)構(gòu)蛋白之外，病毒基因組還編碼幾種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA依賴的RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase,RdRp)、冠狀病毒主蛋白酶(coronavirus main protease,3CLpro)和類木瓜蛋白酶(papain-like protease,PLpro)[12-13]。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，病毒基因組以單鏈RNA的形式釋放。隨后，利用宿主細(xì)胞蛋白翻譯機(jī)制將其翻譯為病毒蛋白，然后通過3CLpro和PLpro將其切割成效應(yīng)蛋白。而RdRp可以合成一條長副鏈RNA模板使其生成出更多的病毒基因組RNA[12-13]。

針對這次暴發(fā)的SARS-CoV-2，已有研究學(xué)者利用最新的基因組測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)方法，快速地鑒定出很多SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白在T和B細(xì)胞上面的抗原決定簇[14-15]。更重要的是，以這些保守的表位序列為靶標(biāo)而設(shè)計(jì)的疫苗，將會保護(hù)機(jī)體并觸發(fā)積極的免疫應(yīng)答對抗SARS-CoV-2的攻擊。

2 新冠疫苗疫苗研發(fā)概況

2.1 新冠疫苗疫苗研發(fā)現(xiàn)狀

開發(fā)安全有效的疫苗對于控制COVID-19的傳播并預(yù)防其未來的二次爆發(fā)具有顯著的重要性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球處于研發(fā)階段的SARS-CoV-2候選疫苗共有超過115種[16]，包括無活性或減毒活病毒疫苗，腺病毒載體疫苗，重組蛋白疫苗，類病毒顆粒疫苗，病毒載體疫苗和核酸疫苗(DNA疫苗和mRNA疫苗)，首批已有多個SARS-CoV-2疫苗進(jìn)入I期和II期臨床試驗(yàn)[6]。以下的報(bào)道主要描述了國內(nèi)外不同類型SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀。

2.2 滅活病毒疫苗

滅活病毒疫苗系用SARS-CoV-2接種Vero細(xì)胞，經(jīng)病毒培養(yǎng)、滅活、純化并吸附特定免疫佐劑制成。目前全球有超過4個COVID-19滅活病毒疫苗處于臨床試驗(yàn)期。例如，在2020年4月12日由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司和中國科學(xué)院武漢病毒研究所聯(lián)合研制的新型冠狀病毒滅活疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，這是全球首個進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的COVID-19滅活病毒疫苗[17]。緊接著在2020年4月13日，由北京科興中維生物技術(shù)有限公司研制的SARS-CoV-2滅活病毒疫苗獲批開展I期臨床試驗(yàn)[7]。與此同時，在2020年4月28日由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司和與中國疾病預(yù)防控制中心(Chinese center for disease control and prevention,CDC)下屬的病毒病預(yù)防控制所合作研發(fā)的新型冠狀病毒滅活疫苗啟動了Ⅰ期臨床試驗(yàn)。令人欣喜的是，2020年6月20日由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所自主研制SARS-CoV-2滅活疫苗在云南省紅河州已正式啟動了II期臨床試驗(yàn)。

2.3 腺病毒載體疫苗

由中國人民解放軍軍事科學(xué)院主導(dǎo)開發(fā)的重組新型冠狀病毒疫苗(Ad5-nCoV)是全球首個進(jìn)入臨床試驗(yàn)的COVID-19腺病毒載體疫苗。該疫苗是可表達(dá)SARS-CoV-2 的S蛋白的復(fù)制缺陷型人腺病毒5型，Ⅰ期臨床試驗(yàn)已于2020年3月16日啟動[18]。目前處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，計(jì)劃招募近500位受試者以評價(jià)不同劑量疫苗的安全性及其免疫原性[19]。除此之外，由英國牛津大學(xué)主導(dǎo)研發(fā)的腺病毒載體的COVID-19候選疫苗(ChAdOx1 nCoV-19)已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)的注冊。該疫苗Ⅰ、Ⅱ期試驗(yàn)將招募近500位處于18至55周歲之間的健康受試者，以評價(jià)疫苗的安全性和疫苗誘導(dǎo)宿主的S特異性抗體、中和抗體以及特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答[20]。

2.4 重組蛋白疫苗

在2020年2月下旬，葛蘭素史克公司(GSK)宣布與中國的三葉草生物制藥公司合作研發(fā)冠狀病毒(COVID-19)候選疫苗[21]。這項(xiàng)合作利用到三葉草公司基于蛋白質(zhì)的冠狀病毒候選疫苗(COVID-19 S-Trimer)與GSK自主研發(fā)的佐劑系統(tǒng)。通過應(yīng)用三聚體融合蛋白技術(shù)和基于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的高效表達(dá)系統(tǒng)，三葉草公司能快速生產(chǎn)出S-三聚體亞基疫苗，再結(jié)合特殊的佐劑系統(tǒng)，從而更好地靶向改進(jìn)先前的非藥物途徑。近日，Generex公司宣布與中國技術(shù)交流中心、北京中華投資基金管理公司、山東省科學(xué)院生物研究所以及中化國際倡導(dǎo)國際產(chǎn)業(yè)發(fā)展組織組成的聯(lián)合協(xié)會簽訂合同，開發(fā)COVID-19疫苗。該公司將利用其Ii-Key免疫系統(tǒng)激活技術(shù)生產(chǎn)用于人類臨床試驗(yàn)的COVID-19病毒肽[22]。

2.5 類病毒顆粒疫苗

2015年，諾瓦瓦斯克公司(Novavax)發(fā)明了一種具有免疫原性的化合物，該化合物由桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中高表達(dá)產(chǎn)生的S蛋白三聚體和MERS-CoV納米類病毒顆粒組成。當(dāng)它們與專有佐劑基質(zhì)M(RN 1235341-17-9)一起給藥時，這種類病毒顆粒制劑在小鼠和轉(zhuǎn)基因牛中都誘導(dǎo)了中和抗體應(yīng)答反應(yīng)。諾瓦瓦斯克公司在2020年2月26日宣布，基于先前研究其他冠狀病毒(包括MERS和SARS)的經(jīng)驗(yàn)，目前正在開展COVID-19候選疫苗的動物測試[23]。他們使用重組納米顆粒疫苗技術(shù)及其專有佐劑Matrix-M開發(fā)出針對SARS-CoV-2的S蛋白的COVID-19候選疫苗[24]。

2.6 基于DNA的疫苗

DNA疫苗是通過編碼抗原的基因插入到真核表達(dá)載體，直接對動物進(jìn)行接種免疫，在誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一門技術(shù)[25]。在一份研發(fā)冠狀病毒疫苗的專利(WO2015081155)中報(bào)道了一種高效的免疫原，其包含來自MERS-CoV刺突蛋白的共有蛋白，可被用于制造靶向MERS-CoV的DNA疫苗。共有刺突蛋白能夠顯著增強(qiáng)宿主的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括增加IgG和中和抗體的效價(jià)和宿主的T細(xì)胞反應(yīng)。

基于先前研究者開發(fā)MERS-CoV疫苗的經(jīng)驗(yàn)，美國Inovio制藥公司研發(fā)出可表達(dá)SARS-CoV-2的 S基因的DNA疫苗(INO-4800)，是已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的預(yù)防性COVID-19候選疫苗，該疫苗通過密碼子優(yōu)化技術(shù)提高了S的表達(dá)水平并增強(qiáng)了其免疫原性。2020年3月2日，Inovio制藥公司首次公布了INO-4800疫苗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小鼠和豚鼠經(jīng)過不同劑量的INO-4800疫苗接種免疫后均可產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答或抗體應(yīng)答[26]。緊接著在2020年4月8日，INO-4800進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，包括評價(jià)DNA疫苗的初步安全性和DNA疫苗誘導(dǎo)的特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答[27]。

2.7 基于mRNA的疫苗

預(yù)防性mRNA疫苗的作用機(jī)制與DNA疫苗類似，也能刺激宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，以及具有將多種mRNA組合成單一疫苗的能力。在Moderna公司的一份專利報(bào)告(WO2017070626)中報(bào)道了一種針對冠狀病毒的mRNA疫苗，該疫苗由編碼來自SARS-CoV和MERS-CoV病毒的S、S1或S2蛋白的mRNA和陽離子納米顆粒組成。他們發(fā)現(xiàn)，與編碼S蛋白S2亞基的mRNA相比，小鼠在接種編碼冠狀病毒全長S蛋白的mRNA后能產(chǎn)生更高的中和抗體效價(jià)?；谙惹暗难邪l(fā)經(jīng)驗(yàn)，Moderna公司在2020年2月24日宣布，他們已生產(chǎn)第一批針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗(mRNA-1273)[28]，這是一種編碼SARSCoV-2融合前穩(wěn)定形式的S蛋白的mRNA疫苗。小瓶裝的mRNA-1273已被運(yùn)送到美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)的下屬部門-美國過敏和傳染病研究所(NIAID)疫苗研究中心，將用于I期臨床試驗(yàn)[29]。除此之外，德國BioNTech公司和美國輝瑞公司共同開發(fā)針對COVID-19的 mRNA疫苗(BNT162)目前也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。該Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)將招募超過7000名健康受試者，評價(jià)不同劑量的COVID-19的 mRNA疫苗的安全性、免疫原性及其免疫保護(hù)能力[30]。

3 新冠疫苗研發(fā)在疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的作用和意義

疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)是近些年在部分生物類專業(yè)新增的一門課程，它的主要實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容是讓學(xué)生進(jìn)一步了解疫苗制造的原理方法并學(xué)習(xí)掌握其生產(chǎn)工藝流程。但是因?yàn)槠浒l(fā)展的歷程較短，涉及的交叉科學(xué)較多如微生物學(xué)和免疫學(xué)等，課程建設(shè)也不完善，很多教學(xué)問題亟待解決。例如很多師生沒有接受過系統(tǒng)的生物安全教育培訓(xùn)，很多學(xué)生沒體會到無菌操作的重要性，實(shí)驗(yàn)教學(xué)時間的安排不夠合理等等。目前，世界各國高校及科研機(jī)構(gòu)正大力研發(fā)新型冠狀病毒疫苗，借鑒他們一些寶貴的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，為疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供重要的參考信息。例如疫苗免疫效果的檢測是評價(jià)疫苗效用的重要手段之一，其實(shí)驗(yàn)教學(xué)離不開傳染性微生物的使用，通過增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)課前的系統(tǒng)而全面的生物安全培訓(xùn)可以有效防止相關(guān)教學(xué)事故的發(fā)生，并且提高了疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。其次是強(qiáng)化疫苗學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的無菌觀念，提高其無菌操作技術(shù)。疫苗的免疫接種是有周期的，如新型冠狀病毒疫苗的免疫接種周期在2周至一個半月左右[7,27]，在疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中合理安排好免疫接種時間，可以保證實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性、完整性和科學(xué)性，使學(xué)生充分理解實(shí)驗(yàn)的目的與意義[31]。

4 結(jié)論與展望

目前世界各國的科研機(jī)構(gòu)以及生物醫(yī)藥公司正在積極地參與SARS-Cov-2疫苗的研發(fā)工作，傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗研發(fā)共同推進(jìn)，疫苗研發(fā)機(jī)構(gòu)、醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)、醫(yī)療單位以及公共衛(wèi)生部門也正加大合作力度和信息資源共享?；谠缧┠暄芯空邔ARS和MERS疫苗研究開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)以及近年來疫苗制備技術(shù)的快速發(fā)展，同時隨著對SARS-Cov-2感染與免疫機(jī)制的闡明和臨床前研究/人體臨床試驗(yàn)評價(jià)工作的推進(jìn)，我們相信SARS-Cov-2疫苗的研發(fā)過程會大大縮短并有望盡快獲批上市，基于SARS-Cov-2疫苗研發(fā)的寶貴經(jīng)驗(yàn)，也對疫苗學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革具有積極的意義。如果有SARS-Cov-2疫苗作為戰(zhàn)略儲備，當(dāng)COVID-19二次暴發(fā)時我們可能再不會如此被動。