★ 魏惠珍 朱敏 金浩鑫 呂尚 吳柳瑾 饒毅*（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 330006）

連翹-金銀花作為藥對(duì)配伍最早出自于清代《溫病條辨》的銀翹散。二藥配伍屬于“七情”之一的相須，并走與上，輕清升浮宣散，清氣涼血，清熱解毒之力倍增，流通氣血以消腫散結(jié)止痛，為臨床常用藥對(duì)［1-2］，在現(xiàn)代藥理中具有抗炎［3］、抗菌、提高免疫力［4］、解熱及抗自由基損傷［5］等作用。目前對(duì)該藥對(duì)配伍的藥理作用［6］、配伍比例、配伍前后揮發(fā)性成分的研究較多［7］，但對(duì)其化學(xué)成分的研究鮮有報(bào)道。封美慧等［8］研究了連翹-金銀花藥對(duì)醇提液的化學(xué)成分變化，林麗美等［9］對(duì)連翹-金銀花藥對(duì)粉末水提液的化學(xué)成分進(jìn)行研究，邢學(xué)鋒［10］對(duì)該藥對(duì)水提液中化學(xué)成分及有效部位的變化進(jìn)行了定量分析?，F(xiàn)有的研究對(duì)連翹-金銀花傳統(tǒng)湯劑化學(xué)成分的研究不夠全面，本文是在傳統(tǒng)湯劑制備的基礎(chǔ)上定量分析該藥對(duì)合煎、單煎、單煎后合并4 種供試品溶液中指標(biāo)成分的含量變化，定性分析了配伍前后化學(xué)成分的增減，更加全面、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯苛诉B翹-金銀花煎液中化學(xué)成分的變化，為該藥對(duì)在臨床及新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)、新依據(jù)。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-20AD 高效液相色譜儀（LC-20AD 泵，SPD-M20A 檢測(cè)器）；梅特勒AB-104N萬分之一電子天平；SHIMADZU AUW220D 十萬分之一電子分析天平；Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）。

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753，純度為96.2%），連翹脂苷A 對(duì)照品（批號(hào)111810，純度94.3%），連翹苷對(duì)照品（批號(hào)110821，純度95.3%），三者均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異綠原酸A 對(duì)照品（批號(hào)2450-53-5，純度大于98%）、異綠原酸B 對(duì)照品（批號(hào)14534-61-3，純度大于98%），兩者均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。10 批金銀花飲片、10 批連翹飲片，購自山東、河南、山西等地；所有樣品均由江西中醫(yī)藥大學(xué)劉勇教授鑒定為真品。

表1 樣品信息

2 煎煮方式

2.1 金銀花單煎 取飲片約20 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加12 倍水，浸泡30 min，一煎武火煮沸，文火煎煮15 min；二煎武火煮沸，文火煎煮15 min；合并兩次濾液，即得金銀花湯劑，并平行制備3 份。

2.2 連翹單煎 按上述“金銀花單煎”方法制得連翹湯劑。

2.3 單煎后合并 將上述單煎得到的濾液，冷卻后按體積比（1∶1）合并，即得單煎后濾液。

2.4 連翹-金銀花合煎 分別取金銀花飲片、連翹飲片各約20 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加12倍水，浸泡30 min，一煎武火煮沸，文火煎煮15 min；二煎武火煮沸，文火煎煮15 min；合并兩次濾液，即得合煎湯劑。（注：?jiǎn)渭搴蠛喜?、合煎飲片均為編?hào)一一對(duì)應(yīng)的飲片。）

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 條件1（綠原酸）：色譜柱 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（12∶88）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

條件2（連翹酯苷A）：色譜柱 welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85），檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定綠原酸、連翹酯苷A 對(duì)照品適量，分別加50%乙醇、甲醇制成濃度分別為39.1 μg/mL 和94.16 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備 取“2”項(xiàng)煎煮液適量，分別用水稀釋5 倍，供連翹脂苷A 含量測(cè)定；分別用水稀釋25 倍，供綠原酸含量測(cè)定。

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別取綠原酸對(duì)照品、供試品和空白溶液，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，空白溶液無干擾。

圖2 含量測(cè)定HPLC圖

3.4.2 精密度試驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)樣對(duì)照品溶液6 次，結(jié)果綠原酸、連翹脂苷A 的RSD 值均在2.0%以內(nèi)，表明儀器的精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“3.3”項(xiàng)下方法平行制備六份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果結(jié)果顯示含量的RSD 值均小于2.0%，表明測(cè)定單煎、單煎后合并、合煎中綠原酸、連翹脂苷A 的方法重現(xiàn)性良好。

3.4.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，制樣后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示供試品溶液中綠原酸、連翹脂苷A 的峰面積的RSD 值均小于3.0%，表明單煎、單煎后合并、合煎溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4.5 線性試驗(yàn) 分別取綠原酸、連翹脂苷A適量，配制濃度為6.7，13.4，26.7，53.5，133.7 μg/mL 綠原酸對(duì)照品溶液和濃度為0，18.8，37.7，94.18，188.3，941.6 μg/mL 連翹脂苷A 對(duì)照品溶液，測(cè)定峰面積，以濃度為（X）為橫坐標(biāo)，峰面積為（Y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果顯示綠原酸回歸方程Y=3.13×107X-1.69×104（r=0.9999），表明綠原酸在6.7～133.7 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；木犀草苷回歸方程Y=1.5×107X-5.78×104（r=0.9999），表明連翹脂苷A 在0～941.6 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量單煎、單煎后合并、合煎的樣品6 份，按100 %加入的量分別加入綠原酸對(duì)照品、連翹脂苷A 對(duì)照品適量，按“3.3”項(xiàng)下方法制備，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示金銀花單煎中綠原酸平均回收率為99.45%（RSD=1.83%）；單煎后合并中綠原酸平均回收率為100.78%（RSD%=1.33%），合煎中綠原酸平均回收率為101.11%（RSD%=1.71%）；連翹單煎中連翹脂苷A 平均回收率為100.44 %（RSD=1.40%）；單煎后合并中連翹脂苷A 平均回收率為100.16%（RSD=1.56%），合煎中連翹脂苷A 平均回收率為99.47%（RSD%=1.64%）；說明測(cè)定單煎、單煎后合并、合煎中綠原酸、連翹脂苷A 方法的準(zhǔn)確性良好。

3.5 含量測(cè)定結(jié)果 取上述“3.3”項(xiàng)下供試品溶液，按上述色譜條件分別測(cè)定合煎、單煎后合并、連翹單煎、金銀花單煎中綠原酸、連翹酯苷A 的含量，結(jié)果見表2。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的非參數(shù)檢驗(yàn)法中H 檢驗(yàn)法分析可知［11-12］，H綠原酸=6.51，H連翹脂苷A=4.62；再由卡方分布的臨界值表可知，H0.01=9.21，因H0.01，可認(rèn)為不同的煎煮方式對(duì)綠原酸、連翹脂苷A 的含量差異基本無影響。

表2 不同煎煮方式綠原酸、連翹酯苷A含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

4 指紋圖譜

4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，95%～88%B，20～50 min，88%～75%B，50～80 min，75%～50%B，80～90 min，50%～90%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取綠原酸、連翹脂苷A、連翹苷、異綠原酸A、異綠原酸B 對(duì)照品適量，加50%乙醇溶解，即得混合對(duì)照品溶液。

4.3 供試品溶液的制備 同上述“2”項(xiàng)制備供試品溶液，直接進(jìn)樣。

4.4 方法學(xué)驗(yàn)證

4.4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣，分別計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于5%，表明該溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

4.4.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，進(jìn)樣6 次，計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于5%，表明該儀器的精密度良好。

4.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于5%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

4.5 合煎指紋圖譜的建立 按“4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定10 批合煎的HPLC 圖譜，將所得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件，采用多點(diǎn)校正將譜峰自動(dòng)匹配，中位數(shù)計(jì)算得出樣品指紋圖的共有模式，結(jié)果見圖3～4。

圖3 合煎與單煎對(duì)照?qǐng)D譜

表3 合煎、合并指紋圖譜相似度結(jié)果

由圖3可知，連翹-金銀花合煎有31個(gè)共有峰，其中峰14 為參照峰。由圖4 中A、B 兩者色譜圖可知，兩者色譜峰的個(gè)數(shù)基本一致，且兩者色譜峰的相似度在0.95 以上，表明兩者化學(xué)成分基本一致；再由圖4 可知，合煎、單煎后合并中色譜峰均能歸屬到單煎的藥材中，說明在該色譜條件下合煎和合并兩者化學(xué)成分基本一致。

5 討論

連翹-金銀花為清熱解毒常用的中藥藥對(duì)，論文以連翹中的指標(biāo)成分連翹酯苷A、金銀花中的指標(biāo)成分綠原酸為考察指標(biāo)，采用 RP-HPLC 方法測(cè)定金銀花和連翹單煎、單煎后合并以及合煎樣品的指標(biāo)成分變化，經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)法中H 檢驗(yàn)法分析可知，合煎、單煎后合并、單煎三者之間的含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同的煎煮方式對(duì)綠原酸、連翹脂苷A 的含量差異較小。

由連翹-金銀花單煎、單煎后合并、合煎指紋圖譜可知，合煎與單煎后合并中色譜峰個(gè)數(shù)一致，且兩者色譜峰的相似度均在0.95 以上，而且合煎、單煎后合并中各色譜峰均能在藥材單煎指紋圖譜中找到，可認(rèn)為單煎與合煎的整體的化學(xué)組成基本一致。

綜上所述，不論從指標(biāo)成分、還是從指紋圖譜整體變化，均表明不同的煎煮方式對(duì)該藥對(duì)的化學(xué)成分影響較小。該研究結(jié)果，可為臨床上該藥對(duì)的使用，提供一定的指導(dǎo)。