嚴(yán) 澎，楊 斌，李文波，何玉清，阮春云

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)又稱紅細(xì)胞因子與促紅素，為人體內(nèi)源性的糖蛋白激素，主要通過(guò)與其受體結(jié)合起作用，具有刺激紅細(xì)胞生成的功能[1]。既往研究顯示EPO不僅在胎兒的肝臟、成年人的腎臟中表達(dá)，也在非造血系統(tǒng)表達(dá)，如神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞。近年來(lái)，研究顯示EPO與腦缺血疾病的進(jìn)展有關(guān)，早期運(yùn)用外源性的EPO對(duì)缺氧缺血性新生大鼠的腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用[2]。本研究通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立慢性腦缺血大鼠模型，探討EPO對(duì)慢性腦缺血大鼠腦組織凋亡與促凋亡蛋白表達(dá)水平的影響，為臨床治療慢性腦缺血病人的藥物設(shè)計(jì)提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 兔抗鼠Caspase-3抗體(上海優(yōu)寧維公司生物科技有限公司)，兔抗鼠Bax抗體(上海優(yōu)予生物科技有限公司)，兔抗鼠Bcl-2抗體(上海恒斐生物科技有限公司)，小鼠抗人Omi/HtrA2抗體(艾美捷科技有限公司)，ECL試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定(TUNEL)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)，EPO(Theramabs)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma)。冷凍離心機(jī)3K15(Sigma)，正置熒光顯微鏡FM-51D(上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司)，全自動(dòng)輪盤式切片機(jī)(LEICA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性16～20周齡SD大鼠96只，體重250～300 g，購(gòu)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK(鄂)2015-0025，購(gòu)回飼養(yǎng)1周，再用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)溫度維持在20～25 ℃，空氣濕度為50%～55%，光照為人工光照，晝12 h、夜12 h，所有大鼠全天飲水自由。

1.3 模型制備與動(dòng)物分組處理 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立慢性腦缺血大鼠模型，選取24只SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組與假手術(shù)組，每組12只，再選取30只SD大鼠作為建模組，用于建立慢性腦缺血模型。建模組大鼠于建模前12 h禁食，腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉，頸部正中進(jìn)行縱向切口，玻璃分針?lè)蛛x雙側(cè)頸總動(dòng)脈，雙線結(jié)扎，電刀切斷頸總動(dòng)脈防止復(fù)流，碘伏消毒，縫合切口，腹腔注射1×105U青霉素，防止感染，術(shù)后24 h內(nèi)蘇醒大鼠納入研究，未蘇醒大鼠剔除，本研究共剔除6只大鼠，剩余大鼠隨機(jī)均分為模型組與EPO組，每組12只。假手術(shù)組大鼠除不進(jìn)行結(jié)扎血管，剩余操作與建模組大鼠相同，對(duì)照組不做任何處理。

造模成功0.5 h后，EPO組大鼠腹腔注射EPO 5 U/(g·d)，連續(xù)注射2周，模型組、假手術(shù)組大鼠腹腔注射同體積的生理鹽水，對(duì)照組大鼠不予任何處理。連續(xù)給藥結(jié)束后，每組大鼠一部分用于神經(jīng)功能評(píng)分、學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試，剩余大鼠用于其他實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分 采用Longa 5級(jí)評(píng)分法評(píng)估藥物干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能評(píng)分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀計(jì)0分；不能伸展右側(cè)前爪計(jì)1分；行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；行走時(shí)向右側(cè)傾倒計(jì)3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失計(jì)4分。

1.4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定逃避潛伏期與空間記憶能力 每組隨機(jī)選取6只SD大鼠用于Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)包括隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)。隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)每只SD大鼠訓(xùn)練量為每日3次，共5 d，觀察并記錄每只SD大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏期)，訓(xùn)練3次的平均值作為該天的成績(jī)；隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練5 d后，撤去平臺(tái)，觀察并記錄每只SD大鼠在120 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)，用于檢測(cè)大鼠的空間記憶能力。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥1 h后，采用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取出完整的腦組織，一部分用于腦勻漿制備，2 000 r/min、10 min，取上清液存儲(chǔ)于-80 ℃環(huán)境中，采用ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織中的MDA含量及SOD、CAT、GSH活性，操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。剩余腦組織一部分保存于-80 ℃環(huán)境中用于蛋白水平檢測(cè)，另一部分固定于4%多聚甲醛用于蘇木精-伊紅(HE)染色與TUNEL檢測(cè)。

1.4.4 HE染色與TUNEL檢測(cè) 處死大鼠，將腦組織置于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，一部分用于HE染色，另一部分根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書操作用于TUNEL檢測(cè)，在顯微鏡下觀察并采集圖像。在TUNEL法檢測(cè)過(guò)程中，隨機(jī)選取10個(gè)視野，記錄100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.5 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè) 提取各組大鼠腦組織總蛋白，采用Bradford調(diào)整蛋白濃度相同，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBST緩沖液漂洗40 min，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，參照ECL試劑盒操作說(shuō)明觀察膜上蛋白條帶，收集影像。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分、逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)比較 與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評(píng)分增加(P<0.05)；與模型組相比，EPO組神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)，120 s穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)；與模型組相比，EPO組逃避潛伏期縮短(P<0.05)，120 s穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分、逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)比較 (±s)

2.2 各組大鼠腦組織SOD、CAT、GSH及MDA含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中SOD、CAT、GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組相比，EPO組腦組織中SOD、CAT、GSH水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織SOD、CAT、GSH及MDA含量比較 (±s)

2.3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況比較 對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、排列整齊、細(xì)胞核大且圓；模型組大鼠腦組織中神經(jīng)元排列紊亂、核固縮、細(xì)胞體積減小且形狀不規(guī)則；EPO組大鼠腦組織中神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組改善較多，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核固縮較少。詳見(jiàn)圖1。對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠腦組織TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞較少，其次為EPO組、模型組。詳見(jiàn)圖2。模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組、假手術(shù)組及EPO組(P<0.05)，對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠腦組織TUNEL檢測(cè)結(jié)果

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較 (±s) 單位：%

2.4 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2、Bcl-2蛋白水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中的Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯下降(P<0.05)，對(duì)照組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，EPO組大鼠腦組織中的Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白凝膠成像結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白水平比較 (±s)

3 討 論

腦缺血是由多種因素引起的腦供血不足所致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，慢性腦缺血是其中常見(jiàn)的病理狀態(tài)之一，常伴發(fā)于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)程中，如腦供血不足、皮質(zhì)下動(dòng)脈硬化性腦病、缺血導(dǎo)致的腦白質(zhì)損害以及腦萎縮等[3]。EPO屬于造血細(xì)胞因子超家族成員，為含有唾液酸的酸性糖蛋白，主要由蛋白質(zhì)、糖類組成，有4個(gè)糖基化位點(diǎn)。EPO與其受體(EPOR)結(jié)合后使其構(gòu)象發(fā)生變化，能夠使JAK2絡(luò)氨酸激酶激活，使EPOR的多個(gè)絡(luò)氨酸殘基磷酸化，激活下游多個(gè)信號(hào)通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶、有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及Janus激酶2(JAK2)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子等[4]。臨床研究顯示，EPO在開(kāi)顱動(dòng)脈瘤夾閉術(shù)后腦缺血治療中效果顯著，能夠幫助病人術(shù)后缺血腦組織微循環(huán)重建，改善腦缺血病人臨床癥狀，并對(duì)神經(jīng)功能有保護(hù)作用[5]。本研究通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立慢性腦缺血大鼠模型以模擬成年人慢性腦缺血癥狀，并用EPO進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，EPO可以降低慢性腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，還可以提高大鼠的記憶能力。臨床研究顯示，在高壓氧治療的基礎(chǔ)上增加EPO治療能夠改善缺氧缺血性腦病患兒神經(jīng)行為，改善腦組織的代謝，并且安全性高[6]。本研究結(jié)果提示EPO對(duì)慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激在神經(jīng)、血管性疾病中發(fā)揮著重要作用，慢性腦缺血存在慢性低灌注的特點(diǎn)，在此過(guò)程中細(xì)胞中的線粒體損傷，從而引起組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧物質(zhì)產(chǎn)生，脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的血腦屏障功能與腦實(shí)質(zhì)造成損傷[7]。同時(shí)在機(jī)體慢性缺血時(shí)，會(huì)抑制海馬突觸的可塑性、沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)活性，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)以及認(rèn)知受損過(guò)程[8]。本研究結(jié)果顯示，EPO可以降低慢性腦缺血大鼠腦組織中MDA含量，增加SOD、CAT、GSH水平。MDA是過(guò)氧化產(chǎn)物的主要成分之一，過(guò)量的自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物會(huì)增加神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷程度，導(dǎo)致腦組織損傷程度加重；SOD具有清除自由基的能力[9-10]；CAT主要是催化過(guò)氧化氫分解成為水和氧；GSH由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，具有抗氧化以及解毒作用。SOD、CAT、GSH共同組成了機(jī)體抗氧化的防御系統(tǒng)，其活性均能反映機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力。石境懿等[11]研究顯示，重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)可以降低新生兒缺氧缺血性腦病導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果表明，EPO可以降低慢性腦缺血大鼠腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少神經(jīng)組織損傷。

慢性腦缺血后腦組織會(huì)出現(xiàn)損傷，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的特定蛋白水平表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞核、線粒體是影響細(xì)胞凋亡的重要因素，線粒體損傷使活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，影響B(tài)cl、Bax比例，細(xì)胞色素C先后與凋亡酶激活因子、Caspase-9結(jié)合，激活Caspase-3，破壞細(xì)胞核內(nèi)的DNA修復(fù)酶促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。本研究結(jié)果顯示，EPO可以降低慢性腦缺血大鼠腦組織的細(xì)胞凋亡率，還可以降低Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平，增加Bcl-2蛋白含量。Bcl-2是線粒體途徑凋亡通路中的重要成員，其高表達(dá)可以抑制多種因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax屬于促細(xì)胞凋亡基因，兩者比值大小可以直接反映細(xì)胞凋亡情況。Omi/HtrA2是新型的促凋亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞處于正常的生理代謝時(shí)，其主要分布于線粒體膜間隙，當(dāng)細(xì)胞收到凋亡信號(hào)時(shí)，會(huì)通過(guò)自我加工(去N端的殘基)穿過(guò)線粒體膜以進(jìn)入胞質(zhì)，通過(guò)與其相關(guān)因子結(jié)合，激活下游的Caspase-3蛋白水平[14]。李晉娜等[15]研究顯示，rhEPO可以促進(jìn)Bcl-2上調(diào)、Bax下調(diào)，改善慢性缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。鄒禮樂(lè)等[16]研究顯示，EPO可以通過(guò)抑制腦組織Omi/HtrA2表達(dá)而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦損傷的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，EPO可以通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白水平抑制慢性腦缺血大鼠腦組織細(xì)胞凋亡。

綜上所述，EPO可以降低Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平，增加Bcl-2蛋白含量，降低大鼠MDA含量，增加SOD、CAT、GSH活性，降低大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，從而減輕腦組織損傷。本研究只是通過(guò)大鼠模型實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行探討，而在臨床上是否存在相似凋亡相關(guān)蛋白水平變化，還需要進(jìn)一步研究。