云金虎，江皓，韓文學，卞健，孫艷艷，張往祥,2*

1(南京林業(yè)大學 林學院，南方現代林業(yè)協同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210037) 2(揚州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚州，225200)

海棠(Malusspp.)為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉小喬木或灌木，主要分布于北溫帶，橫跨歐亞大陸及北美洲[1]。18 世紀海棠由中國等東亞國家傳入歐美，經200 多年的育種積累，培育了大量優(yōu)秀的觀賞品種[2]。目前國內外對于海棠的研究主要側重于觀賞性狀，包含花、葉、果的形態(tài)和色彩等方面[3]，然而海棠也是營養(yǎng)豐富的可用作食品原料和的重要資源。海棠葉茶是以海棠葉為主要原料加工而成的茶葉，在民間有將湖北海棠(M.hupehensis)、山荊子(M.baccata)葉片做茶飲的歷史。研究表明，蘋果屬植物的葉片中不含咖啡因，且無毒性并富含多酚、黃酮、氨基酸等多種營養(yǎng)物質[4],特別是葉片中的二氫查爾酮類化合物，具有緩解酒精造成胃損傷、降血糖和抗氧化的功效[5]。由于植物化學物質對動物生長和代謝具有不同生物活性，其保健作用受到廣泛關注。將海棠葉用作茶飲可有效利用其活性成分。

茶葉中游離氨基酸的含量和比例與茶湯滋味和香氣密切相關[6]。根據其呈味特性可分為甜味、苦味、鮮味和無味4類[7]。游離氨基酸可被人體直接吸收，其含量和成分能反映食品的營養(yǎng)價值，且具有調節(jié)生物體生長發(fā)育和組織修復更新的作用[8]。目前國內外關于各類型茶葉游離氨基酸的組成、呈味特點、營養(yǎng)價值等方面已有較多研究。HORANNI等[9]的研究發(fā)現，γ-氨基丁酸、天冬氨酸、天冬酰胺和茶氨酸的含量可作為區(qū)分不同類型茶葉的標準，并比較了茶葉浸泡時間與游離氨基酸的提取效率之間的關系。YLMAZ等[10]的研究表明，游離氨基酸總量在茶葉萎凋時上升，干燥時下降。然而，目前關于海棠葉茶游離氨基酸組分和營養(yǎng)品質的研究尚未見報道，因此有必要對其進行探究。

本研究選擇在相同條件下栽植的15個海棠品種葉片作為制茶原料，通過分析茶葉中游離氨基酸的組分和差異對游離氨基酸品質指標進行比較和綜合評價，旨在為海棠品種的葉片資源利用、茶葉生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

海棠葉來源于江蘇省揚州市江都區(qū)仙女鎮(zhèn)海棠種質資源圃。在春季選擇生長健康，樹齡相同，每個品種株數大于100的海棠苗進行采摘，將采摘的嫩芽按照綠茶的工藝制作，制作工藝：攤放6 h→150 ℃殺青10 min→揉捻5 min→90 ℃干燥10 min。每個品種的葉茶加工工藝一致。供試海棠品種及編號如表1所示。

表1 供試海棠品種名稱Table 1 Crabapple cultivars studied in the test

1.2 儀器與試劑

S443D型全自動氨基酸分析儀(配有陽離子分析柱LCA K06/Na)，德國Sykam公司；FD5型冷凍干燥儀，美國SIM公司；Milli-Q超純水一體機，美國Millipore公司；氨基酸標準溶液、稀釋緩沖液(12 g/L檸檬酸，pH 2.20的檸檬酸鈉緩沖液)，德國Sykam公司。

1.3 方法

1.3.1 游離氨基酸的測定

依據GB/T 30987—2014《植物中游離氨基酸的測定》[11]的方法并稍作改動。稱取磨碎樣品2 g左右(精確到0.001 g)，加人燒杯中用50 mL煮沸的水沖泡，95 ℃水浴加熱振蕩，提取10 min后取出，利用布氏漏斗和濾紙趁熱抽濾，將濾液進行真空冷凍干燥。干燥后加入適當體積的稀釋緩沖液溶解，過0.22 μm濾膜，采用全自動氨基酸分析儀，對17種游離氨基酸進行上機檢測。分析條件如下：色譜柱LCA K06/Na；流動相A(0.012%檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 3.45)，B(0.02%檸檬酸-檸檬酸鈉，pH 10.85)；溫度58～74 ℃梯度控溫；流速洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min；壓力：3～4 MPa；紫外檢測波長為570和440 nm。

1.3.2 氨基酸營養(yǎng)評價

采用1973年FAO/WHO提出的氨基酸評分(amino acid score，AAS)和必需氨基酸指數(essential amino acid index，EAAI)，并根據FAO/WHO參考模式計算得出,如公式(1)(2)所示。FAO/WHO成人參考模式為必需氨基酸占總氨基酸的比例，依次為Phe+Tyr：3.8，Met+Cys：2.7，Lys：4.5，Thr：2.3，Leu：5.9，Val：3.9，Ile：3.0，His：1.5[12]。計算公式如下：

(1)

(2)

式中:a,某一必需氨基酸的含量;p,待測氨基酸;s,參考評分模式氨基酸;n,參與比較的必需氨基酸的個數。

1.3.3 TAV的計算

味道活性值(taste active value，TAV)定義為滋味物質的濃度與該物質的呈味閾值的比值，TAV與其滋味貢獻呈正相關，當TAV>1 時，表示該物質對整體風味有貢獻，TAV<1時則貢獻較小[13]。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用Excel和Origin 2018進行統計和作圖，采用SPSS 22對組間顯著性進行單因素方差分析,P<0.05差異顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸定量分析

根據表2可知，15個品種海棠葉茶均含有17種游離氨基酸，包含天冬氨酸(Asp)，蘇氨酸(Thr)， 絲氨酸(Ser)， 谷氨酸(Glu)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，纈氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，異亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)， 酪氨酸(Tyr)，苯丙氨酸(Phe)，組氨酸(His)， 賴氨酸(Lys)， 精氨酸(Arg)。從氨基酸組分上來看，Ser的含量顯著高于其他氨基酸，含量在191.2～1 419.93 mg/100 g。游離氨基酸的總量在655.12～3 059.69 mg/100 g，‘時光秀’的總氨基酸含量最高，‘灰姑娘’的最低。不同海棠品種葉茶中氨基酸組成存在顯著差異(P<0.05)。

相對于植物，人類和動物均需要通過食物蛋白來攝取某些氨基酸，這些人體中無法合成的氨基酸稱為必需氨基酸(essential amino acids，EAA)，包括Thr、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、His和Lys[13]。15個品種中EAA占氨基酸總量的8.49%～37.53%，平均值為26.05%。其中‘紫王子’中的EAA含量最低，而‘灰姑娘’和‘黃金甲’的含量最高，分別達到了37.53%和37.41%，接近FAO/WHO提出40%的營養(yǎng)標準，且種類齊全、比例適宜、與人體需要的必需氨基酸結構相符合，易于吸收完全，營養(yǎng)價值較高[12]。

自然界中氨基酸有20多種，其中Glu、Asp、Arg、Gly、The、Tyr、Met、Leu、Lys等9 種氨基酸在植物中含量較少，有些氨基酸人體不能合成，但又是維持機體氮平衡所必需的，稱為藥用氨基酸[14]。其中，Asp有緩解疲勞，預防心臟病、高血壓等疾病的功能[15]。Lys對提高智力、促進生長以及鈣吸收有重要作用，但在植物中含量較少[13]。Arg可通過調節(jié)體內激素分泌，有助于治療矮小癥、糖尿病，改善性欲[15]。Glu是一種重要的功能性氨基酸，具有調節(jié)神經中樞及大腦皮質功能[17]、參與蛋白質的合成、增強腸道屏障功能和抗氧化能力的作用[16]。如表2所示，Glu、Asp和Arg是含量較高的藥用氨基酸，平均含量分別達到了17.67%、9.4%和9.16%，藥用氨基酸含量占氨基酸總量的25.87%～58.14%，含量在50%以上的品種有‘黛玉’、‘平邑甜茶’、‘粉冠’、‘皇家雨點’。藥用氨基酸含量與報道中其他茶類，如枇杷花茶(59.94%)[18]、武夷巖茶(61.29%)[19]、辣木茶(64.08%)[20]等接近，具有較好的保健功能。

從不同品種間氨基酸含量的變異系數來看，Cys、Arg、Ser、Pro變異系數較大，均在70%以上，表明這些氨基酸的含量在品種間差異較大。而Asp、Thr、Gly、Ala變異系數均在40%以下，在品種間差異相對較小。說明雖然在同一地點種植，但由于植物中的氨基酸組成受內在遺傳因素和外在環(huán)境的影響[21]，不同品種間氨基酸組成仍存在較大差異。

2.2 氨基酸營養(yǎng)指數評價

各品種特定氨基酸的AAS值如圖1所示。Thr和His是供試品種中AAS指數最高的氨基酸。其中共6個品種(分別為3、5、7、8、10和13號)有超過半數的氨基酸AAS>1，符合營養(yǎng)模式標準。但在6個品種中Leu、Lys和Cys+Met 的AAS<1，說明含量較為缺乏，屬于限制性氨基酸，即食物所含必需氨基酸的量，與人類所需的蛋白質必需氨基酸的量的比值較低的氨基酸[22]。

總體上這6個品種優(yōu)于其他品種的必需氨基酸組成。Met+Cys的AAS在所有供試品種中均最小，為第一限制氨基酸。而Met+Cys屬于含硫氨基酸，易于從人體流失，通常在蛋類和肉類中含量較多，而在植源性食品中普遍缺乏[12]。

EAAI能夠反映必需氨基酸組成結構的總體營養(yǎng)價值，EAAI越接近100，食物蛋白與參比營養(yǎng)蛋白的必需氨基酸組成越接近，營養(yǎng)價值越高。通常，EAAI≥90，就認為該蛋白有較高的營養(yǎng)價值， 70≤EAAI <90,則認為該蛋白營養(yǎng)價值中等，EAAI <70 則表示營養(yǎng)價值不高。如圖2所示，1號‘紫王子’得分最低，僅26.31，而10號‘灰姑娘’和13號‘黃金甲’的EAAI得分最高，為113.45和113.66，原因在于兩者中存在較高比例的Thr和His，相比標準蛋白模式，營養(yǎng)結構不夠均衡。與模式譜較接近的分別為6號‘黛玉’、3號‘完美紫’和8號‘豐盛’，EAAI依次為98.71、101.41、102.04。

圖1 供試海棠品種氨基酸評分Fig.1 AAS of the crabapple cultivars studied

2.3 呈味氨基酸分析

食物中的氨基酸有非游離態(tài)和游離態(tài)2種形式。非游離氨基酸在食用的過程中不能立即水解，對食物的滋味影響不大。游離態(tài)氨基酸呈味特性可分為4類，鮮味氨基酸(Glu、Asp)、甜味氨基酸(Thr、Gly、Ala、Ser)、苦味氨基酸(Met、His、Arg、Val、Leu、Ile、Tyr、Trp)、無味氨基酸(Cys、Lys、Pro)[7]。由于人味覺神經對不同呈味物質濃度的敏感程度不同，因而呈味氨基酸的含量越高，對滋味的貢獻不一定越大。

圖2 海棠品種必需氨基酸指數Fig.2 EAAI of the protein in crabapple cultivars

TAV用于衡量呈味物質對滋味的貢獻度。海棠葉茶所含的呈味氨基酸TAV如表3所示，平均TAV>1的呈味氨基酸分別是Ser、Asp、Glu、Val、Arg和His。從高到低依次為Glu>Ser>Arg>His>Val>Asp，提供鮮味的Glu和Asp平均TAV達到了6.33和1.01，提供甜味的Ser為3.33，三種苦味氨基酸Val、Arg和His的均值分別為1.34、2.65、2.27。

表3 不同品種海棠呈味氨基酸TAVTable 3 Taste activity values of flavor amino acids in different cultivars of crabapple

在所有品種中，‘時光秀’中的Asp和Glu的TAV最高，分別為2.31和16.57。而‘碩紅’和‘時光秀’中Ser、Arg、Val和His的TAV普遍較其他品種的水平高。盡管茶葉中大部分氨基酸TAV<1,但對風味并非沒有貢獻，滋味的構成并不來源于滋味組分的線性疊加，很多滋味組分在茶湯中具有多個滋味屬性，存在互作結果，可以表現為協同、加和、抑制效應[6]。LIOE等[23]發(fā)現低于呈味閾值的苦味氨基酸，可增強其他氨基酸的鮮味和甜味;劉偉等[24]發(fā)現Phe、Tyr、Arg能增加呈味的復雜性和輔助提升鮮度。

從氨基酸水平來看，海棠葉茶以甜、苦和鮮味共同影響整體滋味，貢獻強度的差異形成了品種間不同的呈味結構。本研究中海棠葉茶總體口感先有微苦，后有甜味，大部分品種間的滋味類似，但存在一定差異。與文獻中海棠葉茶甘甜和苦澀的滋味報道一致[25]。由于茶葉的滋味受內含物質、加工等因素影響，較為復雜。因此，對海棠葉茶滋味的研究需要后續(xù)結合感官評價、滋味稀釋分析(yaste dilution analysis, TDA)和比較滋味稀釋分析(comparative taste dilution analysis, cTDA)等方法，更為系統的進一步篩選出食物中的主要滋味活性物質，并確定其滋味貢獻率的大小[26]。

2.4 不同品種海棠葉茶主成分分析

根據各個品種中游離氨基酸的相對含量作為因子進行主成分分析，如圖3所示。

圖3 不同海棠品種主成分分析Fig.3 Principal component analysis for different crabapple cultivars

15個品種的茶樣得到了很好的區(qū)分，PC1貢獻率42.58%，PC2貢獻率22.64%，前2個主成分總貢獻率65.22%，反映了各個品種中氨基酸組成結構的大部分信息。在橫坐標的最右端，有Ile、Val、Leu、Phe 等多個因子聚集，說明這些氨基酸的含量對PC1正向的貢獻較大，與X軸右側分布的品種呈正相關，與左側的呈負相關。1號位于橫坐標的最左側，在PC1上與Glu、Ala、Asp等氨基酸相關；在PC2上，有12種氨基酸分布在Y軸負向，說明其與第3和第4象限聚集的品種相關，它們在含量上有很大的相似性。4號在Y軸正向分布最遠， Ser與其高度相關，氨基酸相對含量較其他品種有差異。PCA的分析結果直觀地展示了海棠葉茶品種間游離氨基酸結構的相似性。

3 結論

本實驗對海棠葉所制茶葉的游離氨基酸成分和主要營養(yǎng)指標進行分析，結果表明，雖然海棠鮮葉的產地相同，但不同品種間的含量和組成的變異系數差異較大。15種海棠葉茶中Ser、Glu、Arg、Asp和Thr的含量普遍較高。游離氨基酸的總量在655.12～3 059.69 mg/100 g，‘灰姑娘’和‘黃金甲’等有較高比例的必需氨基酸，接近FAO/WHO中40%的標準模式。藥用氨基酸含量占氨基酸總量的25.87%～58.14%，‘黛玉’和‘平邑甜茶’是藥用氨基酸含量較高的品種，Glu是含量最高的藥用氨基酸，而這些藥用成分對于抗疲勞和提高新陳代謝，以及增強人體的抗氧化能力和免疫能力等都有顯著促進作用。根據AAS可知，海棠葉茶中的第一限制氨基酸為Met和Cys。EAAI平衡性最好的品種分別為‘黛玉’、‘完美紫’和‘豐盛’。通過計算TAV，分析了氨基酸對茶葉滋味的貢獻，呈味貢獻較大的氨基酸有3類，分別為甜味(Ser、Asp)、鮮味(Glu)和苦味(Val、Arg、His)氨基酸。此外，通過PCA，根據氨基酸結構特點對不同品種進行了直觀地區(qū)分。

海棠葉茶中具備優(yōu)良蛋白的種質，可以作為一種新型植物蛋白源，提供較高的營養(yǎng)成分。并且與動物蛋白結合，做到良好的互補作用。但制成迎合市場多元化需求的新型功能性飲品，還需進一步結合感官評價，選擇口感易被接受的海棠種質來開發(fā)。由于本實驗選擇的樣品產地來源僅限于揚州市，并未包括全國其他海棠葉原料來源，不能完全代表海棠葉茶品質，因此在今后還需擴大采樣量和采樣范圍，比較不同采收時間海棠葉茶氨基酸品質的區(qū)別，詳細調查氣候條件和管理方式，設計實驗，以明確環(huán)境因素對海棠葉茶氨基酸營養(yǎng)價值的影響，為海棠葉片資源利用提供更多依據。