馬欣，喬俊卿，馬蓉麗*

1(運(yùn)城職業(yè)技術(shù)大學(xué) 健康學(xué)院，山西 運(yùn)城，044000) 2(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京，210014)

櫻桃番茄(LycopersiconesculentumMill. var.cerasiforme)又名圣女果、小番茄，既可作蔬菜又可作水果，口感好，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味獨(dú)特，深受廣大消費(fèi)者青睞。櫻桃番茄果實(shí)皮薄汁多，采后易受到機(jī)械損傷和微生物侵染，貯藏期間易腐爛變質(zhì)[1]，其中因微生物侵染導(dǎo)致的水果病害最為嚴(yán)重和普遍[2]。青霉(Penicilliumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、鐮刀菌(Fusarium)等是引起果蔬貯藏期病害的重要病原真菌，在引水果發(fā)腐爛的同時還能積累真菌毒素，如擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)在低溫貯藏條件下也可侵染果實(shí)產(chǎn)生棒曲霉素、桔霉素等潛在致癌物質(zhì)[3-4]。

目前，采用化學(xué)合成殺菌劑是控制果蔬采后病害的主要方法，但由于化學(xué)殺菌劑的頻繁使用，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，危害人類健康[5]。因此，開發(fā)安全、有效、綠色環(huán)保的天然殺菌劑替代化學(xué)合成殺菌劑已成為當(dāng)前農(nóng)產(chǎn)品采后貯藏與保鮮研究的一個熱點(diǎn)。黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.)又名黃檗，蕓香科(Rutaceae)植物，具有抗菌、抗滴蟲、治療肝炎、抗?jié)?、抗氧化、抗癌等多種藥理活性[6]。研究表明，黃柏提取物對稻瘟病菌、小麥紋枯病菌、稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌、番茄枯萎病菌等多種植物病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用[6-8]。但關(guān)于黃柏提取物對果蔬采后主要致病菌的抑制效果研究較少，尤其是對擴(kuò)展青霉抑菌效果的研究未見報道。本試驗(yàn)以2種重要的櫻桃番茄采后病原菌為靶標(biāo)，系統(tǒng)研究黃柏提取物的抑菌活性，并對其粗提物的最佳萃取劑進(jìn)行篩選，以期為新型天然果蔬保鮮劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃柏

中藥黃柏，購于山西省運(yùn)城市中藥市場，使用枝皮部位。

1.1.2 供試菌種和培養(yǎng)基

鏈格孢(Alternatiaalternata)、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)，中國科學(xué)院微生物研究所，由馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基28 ℃下繼代培養(yǎng)，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 黃柏提取物的制備

采用超聲波輔助醇提取法制備黃柏提取物。將陰干的黃柏枝皮在45 ℃恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱中吹干至發(fā)脆，經(jīng)粉碎后過80目篩備用。稱取樣品干粉100 g，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇按6∶1(mL∶g)的液固比浸泡，充分?jǐn)嚢枋谷軇┩耆]中草藥材料，置于避光處靜置24 h后，在45 ℃，80 Hz的條件下超聲輔助提取30 min，減壓抽濾得濾液，殘渣再次采取同樣方法進(jìn)行處理，重復(fù)提取3次，合并3次濾液。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃條件下減壓濃縮至無溶劑蒸出(呈浸膏狀)，然后用50%的乙醇定容至1 000 g/L，密封標(biāo)記后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 黃柏提取物抑菌活性的測定

1.2.2.1 黃柏提取物對鏈格孢和擴(kuò)展青霉的抑菌效果測定

采用菌絲生長速率法測定抑菌活性。取一定量上述提取液于PDA培養(yǎng)基中混合均勻，制成質(zhì)量濃度為10 g/L的帶藥培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用內(nèi)徑6 mm的打孔器在菌落邊緣生長旺盛區(qū)域打取菌餅，然后用接種針挑至培養(yǎng)皿中心處，每皿1個菌餅，每處理重復(fù)3次。以混有50%乙醇的PDA培養(yǎng)基作為對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)對照組菌落生長至充滿培養(yǎng)皿約80%時，采用十字交叉法測量供試病菌的菌落直徑，按公式(1)計算生長抑制率。

(1)

1.2.2.2 黃柏提取物對鏈格孢和擴(kuò)展青霉最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

菌懸液的制備：無菌條件下，將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d后，用無菌水沖洗至瓶中，經(jīng)過濾后充分振蕩均勻形成孢子懸浮液，采用血球計數(shù)法，使孢子濃度控制在106CFU/mL。

采用二倍稀釋法，將黃柏提取液稀釋成1.95～1 000 g/L共10個質(zhì)量濃度梯度，然后按體積比1∶9的比例與融化的PDA培養(yǎng)基混合，制成提取液終質(zhì)量濃度為0.195～100 g/L含藥培養(yǎng)基，采用平板涂布法，取20 μL供試菌懸液均勻涂于含藥培養(yǎng)基上，以50%乙醇處理作為空白對照，每處理重復(fù)3次，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后觀察，以無菌生長的最低含藥濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)，將無菌生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)7 d后觀察，以無菌生長的最低含藥濃度為最小殺菌濃度(minimum fungicidal,MFC)[9-10]。

1.2.2.3 黃柏提取物對鏈格孢和擴(kuò)展青霉抑菌活性的室內(nèi)毒力測定

將1 000 g/L的黃柏提取液與PDA培養(yǎng)基混合，制成最終質(zhì)量濃度為12、6、3、1.5和0.75 g/L的含藥培養(yǎng)基，按照“1.2.2.1”所述方法，采用菌絲生長速率法測定不同濃度黃柏提取物對病原菌生長的抑制率，每處理重復(fù)3次，以混有50%乙醇的PDA培養(yǎng)基作為對照。使用SPSS 21.0軟件，以黃柏提取液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，平均抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)，計算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,EC50)和置信區(qū)間[11]。

1.2.2.4 黃柏提取物對鏈格孢和擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的影響

采用稀釋平板計數(shù)法測定提取液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用[6]。取黃柏提取物，制成終質(zhì)量濃度為12、6、3、1.5和0.75 g/L的含藥培養(yǎng)基，制備106CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，并稀釋成濃度約100 CFU/mL，吸取20 μL菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，每處理重復(fù)3次，以混有50%乙醇的PDA培養(yǎng)基作為對照；按公式(2)計算抑制率：

(2)

式中：N0，對照組菌落數(shù)；N，涂布提取物平板菌落數(shù)。

1.2.3 黃柏不同極性萃取物的抑菌活性測定

稱取黃柏枝皮干粉100 g，按照“1.2.1”所述方法提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為浸膏，用100 mL超純水溶解后，依次用等體積石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取。各級萃取液經(jīng)減壓濃縮形成浸膏，分別用50%乙醇溶解，定容至質(zhì)量濃度為400 g/L，最終得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，4 ℃保存?zhèn)溆?。?0%乙醇為對照，按照“1.2.2.1”所述方法，采用菌絲生長速率法測定不同萃取相對病原菌生長的抑制率，每處理重復(fù)3次。

1.2.4 黃柏提取物對櫻桃番茄采后黑斑病和青霉果腐病的保護(hù)和治療作用

挑選新鮮、大小均一、成熟度一致、無機(jī)械損傷和微生物侵染的櫻桃番茄，洗凈后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡1～2 min，清水沖洗，室溫晾干備用。

保護(hù)作用試驗(yàn)：配制質(zhì)量濃度為MIC的黃柏提取物，均勻噴灑于櫻桃番茄表面，12 h后用病原菌孢子懸浮液(106CFU/mL)均勻地噴灑于櫻桃番茄表面，待菌液晾干后，置于一次性聚乙烯盒中，用打孔的聚乙烯保鮮袋包裝。治療作用試驗(yàn)：用病原菌孢子懸浮液(106CFU/mL)均勻地噴灑于櫻桃番茄表面，12 h后用質(zhì)量濃度為MIC的黃柏提取物均勻地噴灑于櫻桃番茄表面，果實(shí)自然晾干，置于一次性聚乙烯盒中，用打孔的聚乙烯保鮮袋包裝。

將處理好的櫻桃番茄置于25 ℃條件下放置，每隔3 d測定其發(fā)病率。以無菌水處理的果實(shí)為對照，對照和處理各設(shè)置3個平行，每個平行30個櫻桃番茄，試驗(yàn)重復(fù)3次,通過公式(3)和(4)計算發(fā)病率和統(tǒng)計防治效果。

(3)

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的抑制作用

如圖1所示，黃柏提取物對鏈格孢和擴(kuò)展青霉的菌絲生長均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈均達(dá)到50 mm以上(表1)，抑菌率均達(dá)到70%以上，這可能與黃柏提取物中含有黃酮類和生物堿類等具有抑菌作用的化合物有關(guān)[12]，且黃柏提取物對擴(kuò)展青霉的抑菌活性較強(qiáng)，抑菌率達(dá)到84.5%。

a-c為鏈格孢:a-對照；b-10 g/L黃柏提取物處理； c-12 g/L正丁醇萃取相處理；d-f為擴(kuò)展青霉:d-對照； e-10 g/L黃柏提取物處理；f-12 g/L正丁醇萃取相處理圖1 黃柏提取物及其正丁醇萃取相對鏈格孢、 擴(kuò)展青霉菌絲生長的抑制Fig.1 Inhibitory effect of P. chinense Schneid. extracts and n-buthanol extracts against mycelia growth of A. alternata and P. expansum

表1 黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的抑菌效果Table 1 Antifungal activity of P.chinense Schneid. extracts against A.alternata and P.expansum

此外，鏈格孢和擴(kuò)展青霉對黃柏提取物的敏感性有所不同，如表1所示，黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的MIC分別是25、12.5 g/L，MFC分別是50、25 g/L，因此擴(kuò)展青霉對黃柏提取物的敏感性高于鏈格孢。

2.2 黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的室內(nèi)毒力測定

不同質(zhì)量濃度黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉菌絲生長的抑制效果具有顯著差異。如表2所示，當(dāng)黃柏提取液質(zhì)量濃度為0.75 g/L時，對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的抑制率分別為2.11%和5.83%，隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，抑菌效果明顯提高，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為6 g/L時，抑制率均達(dá)到50%左右，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度增加至12 g/L時，提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的抑制率分別為80.54%和87.45%，抑菌效果最顯著。

以鏈格孢、擴(kuò)展青霉為供試菌進(jìn)行毒力試驗(yàn)，以黃柏提取液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，平均抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)，利用SPSS 21.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得毒力回歸方程。由表1可知，毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明黃柏提取物的質(zhì)量濃度與相對應(yīng)的抑制率之間存在良好的線性關(guān)系，且均呈正相關(guān)。黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的EC50值分別為6.076和4.323 g/L，因此，黃柏提取物對擴(kuò)展青霉的反應(yīng)更靈敏，抑制效果更好，這與抑菌活性的測定結(jié)果一致。

2.3 黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的抑制作用

相同質(zhì)量濃度下，黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)表現(xiàn)出不同的抑制作用，如表2所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為12 g/L時，對鏈格孢、擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的抑制率分別為87.01%和99.33%，對擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的抑制作用更強(qiáng)，幾乎完全抑制擴(kuò)展青霉孢子的萌發(fā)。隨著提取液質(zhì)量濃度的降低，抑制作用均顯著減弱，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.75 g/L時，對擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的抑制率在30%以上，而對鏈格孢的抑制率不到10%。

表2 不同濃度黃柏提取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of different concentrations of P.chinense Schneid. extracts against mycelia growth and spore germination of A.alternata and P.expansum

2.4 黃柏不同極性萃取物對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的抑菌效果

黃柏提取物經(jīng)分步萃取后，依次得到5個萃取相，不同萃取相對鏈格孢和擴(kuò)展青霉的抑菌效果見圖1和表3。與粗提液相比，正丁醇相的抑菌效果最好，對鏈格孢和擴(kuò)展青霉的抑菌圈直徑分別為70.58和75.35 mm，抑菌率均達(dá)到90%以上。氯仿、石油醚、乙酸乙酯和水相對鏈格孢的抑菌率均在60%左右，抑菌效果顯著低于正丁醇相和粗提液；氯仿相對擴(kuò)展青霉的抑菌率為64.97%，抑菌效果次于正丁醇相、粗提液，石油醚、乙酸乙酯和水相的抑菌效果均不到5%，幾乎沒有抑菌作用。粗提液經(jīng)正丁醇萃取后抑菌效果顯著增強(qiáng)，說明黃柏提取物的抑菌活性物質(zhì)主要存在于正丁醇萃取部位，且經(jīng)正丁醇萃取可有效富集黃柏的抗菌活性物質(zhì)。

表3 黃柏提取物不同萃取相對鏈格孢、擴(kuò)展青霉的抑菌效果Table 3 Antifungal activity of different polarity fractions of P.chinense Schneid. extracts against A.alternata and P.expansum

2.5 黃柏提取物對櫻桃番茄黑斑病和青霉果腐病的防治效果

櫻桃番茄是典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后很快進(jìn)入呼吸躍變期出現(xiàn)呼吸高峰，之后呼吸強(qiáng)度逐漸下降，因此果實(shí)極易腐爛變質(zhì)。番茄黑斑病和青霉果腐病是櫻桃番茄采后主要病害，對2種病害的保護(hù)作用試驗(yàn)表明(表4、表5)，在相同的貯藏時間和貯藏條件下，處理組果實(shí)發(fā)病率均顯著低于對照組。貯藏3 d時，處理組對番茄黑斑病和青霉果腐病的防治效果分別為64.94%和86.67%；貯藏6 d時，防治效果分別為47.51%和68.82%；隨著貯藏時間的延長，發(fā)病率均呈逐漸上升的趨勢，對照組的發(fā)病率增加速度較快，貯藏9 d時，對照組2種病害的發(fā)病率都已超過90%，而處理組的發(fā)病率仍然顯著低于對照組，分別為60.74%和42.22%。治療作用試驗(yàn)表明(表4、表5)，在相同的貯藏時間和貯藏條件下，經(jīng)提取物處理的果實(shí)發(fā)病率均顯著低于對照組，且隨著貯藏時間的延長，果實(shí)的發(fā)病率逐漸增大。但在相同貯藏時間下，黃柏提取物對2種病害的治療防治效果均低于保護(hù)防治效果。說明質(zhì)量濃度為MIC的提取物表現(xiàn)了顯著的保護(hù)和治療作用，且保護(hù)防治效果更好，黃柏提取物可顯著減緩櫻桃番茄果實(shí)的腐爛速度，且對青霉果腐病的抑制效果更好，這一結(jié)果與提取物抑菌活性的離體測定結(jié)果一致。

表4 黃柏提取物對櫻桃番茄采后黑斑病的保護(hù)及治療作用Table 4 Protective and therapeutic effects of P.chinense Schneid. extracts on black rot disease in postharvest cherry tomato

表5 黃柏提取物對櫻桃番茄采后青霉果腐病的保護(hù)及治療作用Table 5 Protective and therapeutic effects of P.chinense Schneid. extracts on blue mold fruit rot disease in postharvest cherry tomato

3 結(jié)論與討論

新型、高效的天然殺菌劑是近年來國內(nèi)外研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，本試驗(yàn)以黃柏為材料，研究了其對櫻桃番茄主要采后病原菌——鏈格孢和擴(kuò)展青霉的抑菌作用。研究結(jié)果表明，黃柏提取物對這2株病原真菌均有良好的抑菌效果，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為12 g/L時，對鏈格孢和擴(kuò)展青霉的菌絲生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率均達(dá)到80%以上，而吳振宇等[13]報道當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為60 g/L，黃柏對鏈格孢的抑菌率才能達(dá)到80%以上，抑菌濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)結(jié)果，這可能與提取物制備方法不同有關(guān)，與水提法相比，超聲波輔助醇提取法所制備的提取物抑菌活性更強(qiáng)，利用超聲波振動增加溶劑進(jìn)入植物細(xì)胞的滲透性，強(qiáng)化被提取物在植物細(xì)胞與提取介質(zhì)間的傳質(zhì)速率[14]，同時，提取液中除了水溶性的成分外，還有不溶于水的有效成分存在，可大大提高抑菌作用。研究還發(fā)現(xiàn)，相同濃度下，黃柏提取物對擴(kuò)展青霉的抑制作用高于鏈格孢，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為12 g/L時，對擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)抑制率接近100%，且MIC、MFC以及EC50值均相對較小，說明擴(kuò)展青霉對黃柏提取物的反應(yīng)更敏感。

在室內(nèi)活體防效測定試驗(yàn)中，黃柏提取物對櫻桃番茄果實(shí)黑斑病和青霉果腐病均表現(xiàn)出顯著的保護(hù)和治療作用，且保護(hù)作用更強(qiáng)，在果實(shí)貯藏12 d后，對照組全部腐爛，保護(hù)作用試驗(yàn)處理組黑斑病和青霉果腐病的發(fā)病率分別降低了21.11%和38.52%，這與黃柏提取液本身具有抑菌作用密切相關(guān)，在櫻桃番茄采后貯藏期間能有效減少病原真菌的侵染和病害的發(fā)生。因此，黃柏可以作為開發(fā)天然防腐保鮮劑的材料，具有較好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。有研究表明，黃柏的主要化學(xué)成分為黃酮類和生物堿類，此外還含有易揮發(fā)的萜類化合物[8]，但具體有效抑菌活性成分仍不清楚，本試驗(yàn)采用溶劑萃取對黃柏提取物進(jìn)行了初步分離，研究發(fā)現(xiàn)，正丁醇萃取物對鏈格孢和擴(kuò)展青霉的抑菌率均達(dá)到90%以上，這一結(jié)果與萬春鵬等的研究結(jié)果一致[16]，說明黃柏提取物的抑菌活性物質(zhì)主要存在于正丁醇萃取部位，本研究為進(jìn)一步分離、純化和鑒定抑菌活性成分奠定基礎(chǔ)，同時也為開發(fā)新型、天然、經(jīng)濟(jì)、有效果蔬保鮮劑提供了線索和依據(jù)。