張毅，萬金慶,2,3*，楊帆，冷爭爭

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306) 4(安徽宜康高新農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽 六安，237200)

牡蠣是一種雙殼軟體動物，肉質(zhì)柔軟，味道鮮美，銷售形式主要為帶殼銷售或出售去殼肉制品[1]。研究表明，長時間運輸和?；钸^程會使牡蠣的外觀、氣味和腐敗菌含量發(fā)生顯著變化，有效的貯藏手段是牡蠣品質(zhì)安全的重要保障[2]。牡蠣常見的貯藏方式有干制、冷藏和凍藏，近年來超高壓處理、氣調(diào)包裝、涂膜及輕度熱處理等技術(shù)在牡蠣貯藏研究中受到廣泛關(guān)注[3-4]。然而牡蠣干制過程時間較長，干制后營養(yǎng)成分損失嚴重，冷藏貯藏期短難以滿足消費要求，凍藏貯藏期6個月，但凍結(jié)過程中冰晶刺破細胞，解凍后營養(yǎng)成分流失嚴重，品質(zhì)降低[5]。近年來牡蠣的貯藏研究大都從貯藏的外在環(huán)境條件著手，通過優(yōu)化貯藏條件提升貯藏品質(zhì)，本研究回歸牡蠣本身，以低鹽冰溫脫水方式降低牡蠣自身水分含量，以期改善其貯藏品質(zhì)。

牡蠣含水率>80%，是其不耐藏的重要原因，目前低鹽(<6%)高水分(>50%)食品符合人們健康飲食需求，市場反響良好[6-7]。20世紀70 年代，冰溫技術(shù)出現(xiàn)，以其貯藏過程中食品不凍結(jié)、貯藏品質(zhì)高和貯藏周期長受到廣泛關(guān)注。本實驗以質(zhì)量分數(shù)1%NaCl鹽水注射，冰溫脫水至含水率(60±1)%，得到低鹽冰溫脫水牡蠣。目前，類似研究還未見報道，本文通過探究其在冷藏和冰溫條件下的貯藏特性，為牡蠣高品質(zhì)流通提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

質(zhì)量為(150±10) g的整只太平洋牡蠣(Crassostreagigas)，購于南匯新城農(nóng)貿(mào)市場，置于冰盒中快速運回實驗室。洗凈表面，開殼取肉。稱重記錄牡蠣肉總質(zhì)量及單個質(zhì)量，按牡蠣總質(zhì)量的1%(質(zhì)量分數(shù))確定食鹽用量并配制成飽和食鹽水，通過單個牡蠣質(zhì)量與牡蠣總質(zhì)量之比確定單個牡蠣飽和食鹽水注射量(例如：某批實驗?zāi)迪犎鈽悠饭? 600.0 g，則總食鹽用量為36.0 g。室溫20 ℃下食鹽溶解度為36 g/100 g水，飽和食鹽水密度1.33 g/cm3。需要飽和食鹽水共136.0 g，約102.3 mL)，假設(shè)某只牡蠣去殼后質(zhì)量為25.0 g，按1%(質(zhì)量分數(shù))計算注射量為：

(1)

用2.5 mL無菌注射器模擬鹽水注射機進行注射，注射點選擇閉殼肌中心以及沿腮絲方向約5 mm位置的牡蠣組織，注射過程中閉殼肌周圍開始均勻滲液，組織緩慢充盈則視為均勻，批量生產(chǎn)可利用鹽水注射機實現(xiàn)。

經(jīng)鹽水注射的牡蠣置于冰溫干燥裝置托盤進行脫水處理(圖1)，電腦操作界面通過圖1中的質(zhì)量傳感器實時監(jiān)測牡蠣含水率變化，冰溫真空脫水至含水率為(60±1)%時，停止脫水過程，取出物料。牡蠣樣品低鹽冰溫脫水后1個/包進行封裝，封裝好的牡蠣分別置于冷藏條件(4.0±0.5) ℃和冰溫條件[(-2.0±0.5) ℃]下進行貯藏，每3 d測定1次。對于實際生產(chǎn)中牡蠣含水率控制，可參照凍干食品的方法，先在實驗機上得到工藝參數(shù)，再移植到生產(chǎn)機上。

1-冷阱制冷機組；2-真空壓力變送器；3-手閥；4-放氣閥；5-電動蝶閥；6-止油閥；7-真空泵；8-漏氣閥； 9-物料；10-托盤；11-電加熱板； 12-質(zhì)量傳感器；13-真空箱；14-排水閥；15-冷阱圖1 冰溫干燥裝置Fig.1 Controlled freezing-point dried device

1.2 實驗儀器

VS-1300-SU型超凈臺,江蘇凈安泰集團；LHS-150HC恒溫恒濕箱,上海一恒科學儀器有限公司；Kjeltec2300 凱氏定氮儀,丹麥福斯公司；H-2050R-1 高速冷凍離心機,湘儀離心機有限公司；PQ 001紐邁臺式脈沖核磁共振分析儀,上海紐邁公司；CM1100冷凍切片機,德國徠卡測量系統(tǒng)有限公司；Eclipse E200生物顯微鏡,日本尼康儀器有限公司；課題組自行研制的冰溫干燥裝置[8]，該裝置與現(xiàn)有凍干裝置主要不同點在于脫水過程中物料溫度始終控制在其冰溫帶內(nèi)，避免了冷凍引起的蛋白質(zhì)變性、組織結(jié)構(gòu)受到破壞等問題。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官評定

參考HE等[8]和CHEN等[9]方法，略有改動。小組由經(jīng)過訓練的10人組成，每隔3 d分別對冰溫貯藏組和冷藏組進行感官評定，感官評價見表1，每組設(shè)置3個平行樣。分別從牡蠣的氣味、組織色澤和閉殼肌色澤、組織質(zhì)地、外套膜色澤和腮絲形態(tài)對牡蠣進行感官評價。感官評分分為4個等級(0、1、2和3分)，得分越低代表整體質(zhì)量越高，評價結(jié)果采用質(zhì)量指數(shù)法(quakity index method,QIM)進行分析，當?shù)梅?9分時認為品質(zhì)不可接受。

表1 牡蠣感官評定表Table 1 Sensory evaluation criterion for oyster

1.3.2 菌落總數(shù)測定

參考CHEN等[10]方法,略有改動。無菌操作取10 g牡蠣組織于無菌均質(zhì)袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)1 min。吸取1 mL均質(zhì)液進行10倍系列稀釋，在不同測定時期選取2～3個合適稀釋度，每個稀釋度3個平行，吸取0.1 mL樣品液接種于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h進行計數(shù)。

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮測定

依據(jù)GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[11]中的分析方法進行測定分析。

1.3.4 硫代巴比妥酸值測定

依據(jù)GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[12]中的分析方法進行。

1.3.5 TCA-可溶性肽測定

參考KUMAR等[13]方法,略有改動。3 g樣品加入27 mL 50 mg/mL的三氯乙酸(trichloracetic acid,TCA)溶液，組織勻漿1 min，置于4 ℃冰箱1 h，4 ℃、12 000×g離心10 min。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作為標準品，采用Lorry法[14]進行含量測定，結(jié)果以mg/g牡蠣樣品表示。

1.3.6 低場核磁共振

參考李海濤[15]方法,略有改動。為防止水分流失，使用保鮮膜將牡蠣封閉包裝。冰溫貯藏和冷藏均放置于恒溫恒濕箱中，設(shè)置2個平行樣。每次測試結(jié)束后放回用于下一時間點的測試。將待測牡蠣進行低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)分析，確定檢測參數(shù)后使用CPMG (carr-purcell-meiboom-gill)序列采集橫向弛豫信號。采用70 mm射頻線圈，參數(shù)如下：譜儀頻率SF=21 MHz，采樣頻率SW=100 kHz，模擬增益RG1=20，脈沖時間P1=19 μs，脈沖時間P2=37 μs，數(shù)字增益DRG1=4，模擬增益RG1=20，前置放大增益PRG=1，采樣點數(shù)TD=199 958，重復(fù)采樣間隔時間TW=4 000 ms，累加次數(shù)NS=8，回波時間TE=0.4，回波個數(shù)NECH=5 000。

1.3.7 核磁成像分析

參考王碩等[16]方法,略有改動。保鮮膜封裝牡蠣進行核磁成像(magnetic resonance imaging，MRI)分析，冰溫貯藏和冷藏均放置于恒溫恒濕箱中，每次測試結(jié)束后迅速放回用于下一時間點的測試。重復(fù)等待時間TR=550 ms，回波時間TE=20 ms，磁體線圈管直徑70 mm，成像后的圖片進行映射和偽彩處理。

1.3.8 微觀組織結(jié)構(gòu)觀察

參考余文暉等[17]方法,選擇牡蠣閉殼肌進行微觀組織結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 25、Excel 2013和Origin 8.5分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價

QIM廣泛用于水產(chǎn)品的感官評價，通過評價各個具體指標進行感官打分，每個參評指標的分數(shù)≤3分，使得單項得分對總分的影響更加均衡，各項指標得分相加得到最終感官評價分數(shù)[9]。感官評價結(jié)果見表2，貯藏期間，隨著時間延長，牡蠣QIM得分越來越高，品質(zhì)逐步下降。第0天時，冰溫貯藏組和冷藏組在感官評價上無顯著差別(P>0.05)，但從第3天開始2組間感官評分開始差異顯著(P<0.05)，同一組別，不同貯藏時間內(nèi)牡蠣的貯藏品質(zhì)也顯著不同(P<0.05)。冰溫貯藏和冷藏過程中以氣味、外套膜色澤和腮絲形態(tài)變化最為明顯，這與CHEN等[10]結(jié)論一致。以9分作為品質(zhì)接受界限，冰溫組牡蠣的貯藏24 d，冷藏貯藏12 d后牡蠣品質(zhì)變得不可接受。

表2 感官評價累計得分Table 2 Cumulative scores for sensory tests

2.2 菌落總數(shù)測定

牡蠣貯藏期間菌落總數(shù)變化如圖2所示。貯藏初期，冷藏和冰溫貯藏樣品的初始菌落總數(shù)分別為4.02 lg CFU/g和3.97 lg CFU/g。依據(jù)107CFU/g作為牡蠣品質(zhì)的不可接受界限[18]，冰溫條件下低鹽冰溫脫水牡蠣的貯藏期為24 d，在冷藏的基礎(chǔ)上延長了1倍。研究表明低溫條件下許多腐敗菌仍能生長繁殖，部分腐敗菌在0 ℃下也能存活[19]。但與冷藏相比，冰溫條件下微生物繁殖速率顯著降低，同時冰溫脫水使得牡蠣自身水分含量(特別是微生物可直接利用的自由水)下降，微生物生長繁殖受到抑制，因此冰溫貯藏條件與自身低含水率的特點是影響低鹽冰溫脫水牡蠣菌落總數(shù)增長速率的重要因素。

圖2 牡蠣菌落總數(shù)和TVB-N變化Fig.2 Changes of total bacterial count and TVB-N of oysters

2.3 TVB-N測定

由于微生物和酶的共同作用使得蛋白質(zhì)不斷分解，尤其是對氧化三甲胺以及氨基酸側(cè)鏈的作用，產(chǎn)生了具有揮發(fā)性的氨及胺類物質(zhì)，使得TVB-N發(fā)生積累[20]。郭曉偉等[3]以20 mg N/100 g作為牡蠣品質(zhì)的劣變界限，得出冷藏貯藏期為6 d，冰溫貯藏期為12 d的結(jié)論，這是由于冰溫抑制了相關(guān)酶及微生物作用，與冷藏相比減少了揮發(fā)性的氨及胺類物質(zhì)的產(chǎn)生。如圖2所示，冷藏條件第15天TVB-N值為21.32 mg N/100 g，冰溫條件下貯藏TVB-N值第27天達到20.24 mg N/100 g，超過該界限值。綜合分析表明，牡蠣經(jīng)低鹽冰溫脫水處理后貯藏期明顯提升。這可能是因為牡蠣冰溫脫水后自身低含水率不利于微生物生長繁殖，與冰溫條件有效結(jié)合形成柵欄效應(yīng)，延長了牡蠣的貯藏期，彌補了自身因含水率高在傳統(tǒng)貯藏過程中的不足。

2.4 TBA值測定

TBA值的大小反映脂質(zhì)氧化情況，是評價水產(chǎn)品腐敗情況的重要指標。圖3表明牡蠣TBA值在冰溫貯藏過程中增長緩慢，0 d為(0.19±0.01) mg MDA/kg，27 d達到(1.17±0.08) mg MDA/kg，冷藏條件下TBA值第15天上升至(0.70±0.05) mg MDA/kg，遠高于冰溫貯藏同期。原因可能是脂質(zhì)氧化主要受到自由基鏈反應(yīng)的影響，而冰溫條件下脂肪酶活性降低，自由基形成受到抑制，鏈反應(yīng)速率下降[21]。因此冰溫貯藏有效延緩脂質(zhì)氧化，與冷藏相比TBA值增加緩慢。

圖3 牡蠣TCA-可溶性肽和TBA變化Fig.3 Changes of TCA-soluble peptide and TBA of oysters

2.5 TCA-可溶性肽測定

TCA-可溶性肽含量增加，說明貯藏過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性和降解[22]。圖3表明冷藏條件下TCA-可溶性肽含量增加更快，貯藏期內(nèi)檢測到的峰值更高，含量由(6.66±0.75) mg/g增加至(40.64±1.20) mg/g；冰溫條件下，0 d TCA-可溶性肽含量為(6.29±0.90) mg/g，第27天達(38.25±1.40) mg/g。JIA等[23]研究表明，肌肉蛋白水解早期主要由內(nèi)源酶產(chǎn)生作用，同時脂質(zhì)氧化和非自由基(H2O2、脂質(zhì)氫過氧化物)的修飾也能導致蛋白質(zhì)變性和降解。冰溫抑制內(nèi)源酶活性，牡蠣脫水后由于自由水含量下降導致反應(yīng)底物流動性降低，因此冰溫貯藏結(jié)合低鹽冰溫脫水對延緩牡蠣蛋白質(zhì)降解具有明顯優(yōu)勢，貯藏過程中檢測到的TCA-可溶性肽峰值低，增速緩慢。

2.6 LF-NMR分析

如圖4所示，牡蠣在冰溫和冷藏條件下的橫向弛豫時間T2反演之后均穩(wěn)定得到3個峰。峰T21出現(xiàn)在0～10 ms，為結(jié)合水，這部分水通常與大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、淀粉)或者肌纖維緊密結(jié)合，其性質(zhì)相對穩(wěn)定；峰T22出現(xiàn)在10～100 ms，為不易流動水，這部分水通常存在于肌肉纖維內(nèi)，貯藏過程中變化明顯；峰T23>100 ms，為自由水，在貯藏過程中極不穩(wěn)定[24]。3種不同狀態(tài)水分的橫向弛豫時間T2變化見表4。

如表4所示，在冰溫和冷藏條件下，隨著貯藏時間增加，3種水分的峰強度呈下降趨勢，冷藏過程中下降明顯，說明冷藏條件水分更易流失。2種貯藏條件下隨著貯藏期延長，橫向弛豫時間T22、T23呈明顯下降趨勢，T21規(guī)律性不強。貯藏時間增加，橫向弛豫時間T2縮短，這說明在貯藏的過程中不易流動水和自由水的流動性減弱。因此，將橫向弛豫時間T22、T23與傳統(tǒng)品質(zhì)指標感官評分、TVB-N和菌落總數(shù)進行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

a-冰溫貯藏; b-冷藏圖4 冰溫貯藏和冷藏條件下牡蠣的橫向弛豫 時間T2反演圖Fig.4 Inversion spectrum of transverse relaxation time T2 of oysters during ice temperature storage and cold storage

表4 牡蠣貯藏過程中橫向弛豫時間T2的變化Table 4 Changes of transverse relaxation time T2 of oysters during storage

表5 牡蠣冰溫和冷藏條件下橫向弛豫時間T2與TVB-N、 感官評分及菌落之間的相關(guān)性分析Table 5 Linear regression analyses between transverse relaxation time T2 and TVB-N, sensory and total bacterial count

Pearson 相關(guān)性分析表明橫向弛豫時間T22與牡蠣的品質(zhì)變化顯著相關(guān)(P<0.05)。橫向弛豫時間T23僅與TVB-N相關(guān)性顯著(P<0.05)，這是由于自由水極不穩(wěn)定，冰溫脫水過程中自由水含量發(fā)生明顯變化，使得貯藏過程中其遷移規(guī)律與牡蠣品質(zhì)變化相關(guān)性降低。因此橫向弛豫時間T22對該牡蠣樣品的品質(zhì)變化更具有指導意義。

反演峰T21、T22和T23的峰值面積可表示3種不同狀態(tài)水分的信號幅值，各峰值面積占峰值總面積之比S21、S22和S23可以間接反映3種狀態(tài)水分的相對含量[25]，貯藏過程中其相對含量變化見圖5。

蛋白質(zhì)降解使得部分結(jié)合水被釋放造成冰溫和冷藏條件下S21顯著降低2.66%和1.62%(P<0.05)。冰溫條件下S23沒有顯著波動，冷藏條件下S23顯著增加1.39%(P<0.05)，自由水占比上升，說明水分流失加劇。冷藏條件下S22無顯著變化，冰溫條件下S22顯著增加2.84%(P<0.05)，不易流動水含量越高表明其保水性越好[26]。這可能是由于冰溫條件下細胞為了防止凍結(jié)，細胞中由糖、醇和蛋白質(zhì)等組成不凍液，使得水分流動性下降，流失減少。而在冷藏條件下水分向流動性更大的自由水遷移，保水性降低，水分流失增加，品質(zhì)下降。

a-冰溫貯藏; b-冷藏圖5 冰溫貯藏和冷藏過程中橫向弛豫時間T2峰變化Fig.5 Changes of T2 peak distribution duringice temperature storage and cold storage

2.7 MRI分析

在MRI圖中，紅色區(qū)域?qū)?yīng)高質(zhì)子密度區(qū)域，藍色區(qū)域?qū)?yīng)低質(zhì)子密度區(qū)域，進行映射和偽彩處理后的圖像越趨近紅色表明該區(qū)域的質(zhì)子信號越強，水分含量越高[23]。冰溫貯藏和冷藏過程中牡蠣MRI圖見圖6。牡蠣前處理過程中水分散失不均勻，MRI圖顯示0 d牡蠣質(zhì)子密度中間強四周弱，隨著貯藏時間延長，2種貯藏條件下腮絲部分幾乎完全變?yōu)樗{色，水分流失明顯。冷藏條件下，牡蠣整體質(zhì)子密度降低，表明水分含量逐漸下降。冰溫條件下，牡蠣局部質(zhì)子信號隨著貯藏時間延長逐漸增強，水分逐漸積累。前文分析表明冷藏條件下脂質(zhì)氧化速率以及蛋白質(zhì)的變性降解速率均高于冰溫貯藏，這使得肌肉纖維之間間隙增加，結(jié)合緊密程度降低，加速水分向外擴散流失，這可能是冷藏條件下牡蠣質(zhì)子密度明顯降低的重要原因，而冰溫條件下產(chǎn)生的不凍液在貯藏過程中積累造成牡蠣局部質(zhì)子密度增強，這部分水流動性不強，該結(jié)果側(cè)面驗證了冰溫貯藏過程中S22上升，不凍液與產(chǎn)品貯藏過程中的品質(zhì)和風味密切相關(guān)，表明冰溫貯藏與冷藏相比更有效提升牡蠣貯藏品質(zhì)。

a-冰溫貯藏; b-冷藏圖6 冰溫貯藏和冷藏條件下牡蠣的偽彩圖Fig.6 False-colour image of the water proton density in oyster during ice temperature storage and cold storage

2.8 微觀組織結(jié)構(gòu)觀察

圖7-a、7-b分別是低鹽真空脫水牡蠣進行冰溫貯藏和冷藏過程中微觀組織結(jié)構(gòu)變化，貯藏過程中牡蠣肌肉結(jié)構(gòu)變化可以對牡蠣貯藏品質(zhì)進行評價。貯藏0 d，冰溫與冷藏條件下牡蠣肌肉纖維均排列整齊、結(jié)合緊密，無明顯的斷裂、扭曲，結(jié)締組織清晰可見(圖7-a與圖7-b第0天箭頭標記)。冰溫貯藏從第21天開始，肌肉纖維間距開始增加，部分開始扭曲、斷裂，同時結(jié)締組織發(fā)生明顯降解(圖7-a第21、24和27天箭頭標記)。

a-冰溫貯藏; b-冷藏圖7 冰溫貯藏冷藏條件下牡蠣的微觀組織結(jié)構(gòu)圖Fig.7 Microstructure of oyster during ice temperature storage and cold storage

對比圖7-a，從圖7-b發(fā)現(xiàn)，冷藏條件下類似情況出現(xiàn)在第12天(圖7-b第12、15天箭頭標記)，劣變時間明顯提前，品質(zhì)降低。微觀組織結(jié)構(gòu)受脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解影響明顯，因此微生物作用和自身內(nèi)源酶活性是影響微觀組織結(jié)構(gòu)的重要因素[27]。貯藏后期2種貯藏條件下微觀組織結(jié)構(gòu)劣變與菌落總數(shù)的增加密切相關(guān)，肌肉纖維以及結(jié)締組織的降解也是TVB-N值上升、TCA-可溶性肽含量增加以及感官得分降低的主要原因。

3 結(jié)論

綜合感官評價、菌落總數(shù)和TVB-N進行分析，牡蠣經(jīng)低鹽冰溫脫水處理能有效延長其貯藏期，冷藏條件下可貯藏12 d，相比而言，冰溫貯藏能更好延緩脂質(zhì)氧化以及蛋白質(zhì)的降解、變性，使得貯藏期內(nèi)微觀組織結(jié)構(gòu)更加完整有序，貯藏期達到24 d。

LF-NMR結(jié)果表明，貯藏過程中橫向弛豫時間T22、T23呈明顯下降趨勢，Pearson 相關(guān)性分析表明橫向弛豫時間T22與牡蠣的品質(zhì)變化顯著相關(guān)(P<0.05)。MRI分析表明冰溫條件下牡蠣局部存在質(zhì)子強度增加、水分積累的現(xiàn)象，表明冰溫貯藏保水性更好，而冷藏條件下水分流失明顯。與傳統(tǒng)冷藏6 d和冰溫貯藏12 d的貯藏期相比[3]，低鹽冰溫脫水牡蠣貯藏期明顯提高，為牡蠣高品質(zhì)貯藏運輸方式提供了新的理論依據(jù)。