蘆鑫，賈聰，王瑞丹，高錦鴻，張麗霞，孫強(qiáng)，趙謀明，黃紀(jì)念*

1(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州，450002) 2(河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州，450002) 3(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

目前，高血壓成為危害我國(guó)居民健康的常見(jiàn)疾病之一，我國(guó)成人高血壓患者達(dá)2.45億，高血壓前期患者高達(dá)4.35億[1]。為治療高血壓，研究者開(kāi)發(fā)出抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)活性的降壓藥物，盡管藥物有明確藥效，但會(huì)引發(fā)皮疹、咳嗽、味覺(jué)障礙等副作用[2-4]。由于食源ACE抑制肽具有高安全性、高耐受性等優(yōu)點(diǎn)，因而成為預(yù)防與治療高血壓的研究熱點(diǎn)[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與高血壓密切相關(guān)。氧化應(yīng)激通過(guò)干擾血壓調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，加劇血管內(nèi)皮功能障礙[6]，攻擊低密度脂蛋白導(dǎo)致膽固醇在血管壁沉積，促進(jìn)高血壓發(fā)生發(fā)展；另一方面，高血壓加重血管損傷，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自由基形成，加重氧化應(yīng)激[7-8]?？刂蒲趸瘧?yīng)激對(duì)于緩解高血壓有積極作用，因此，具有降壓與抗氧化的雙活性肽具有較高的研究?jī)r(jià)值。

目前，關(guān)于降壓與抗氧化的雙活性肽研究較少，多處于活性發(fā)現(xiàn)階段，如GARCIA-MORA等[9]從扁豆蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)具有降壓與抗氧化的雙活性肽；TANZADEHPANAH等[10]合成出具有降壓與抗氧化的活性肽KDEDTEEVP和KDEDTEEVH。有關(guān)降壓與抗氧化的雙活性肽的構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)制研究較少，有必要開(kāi)展相關(guān)研究。

芝麻蛋白是抗氧化肽與ACE抑制肽的前體[11-12]。課題組前期從芝麻蛋白水解產(chǎn)生的多肽中，篩選出具有降血壓與抗氧化的雙活性肽QCKH。本文通過(guò)比較相似性指數(shù)分析法(comparative molecular similarity index analysis,CoMSIA)研究其降壓與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系，并利用分子拼接分析其與人體血管緊張素蛋白轉(zhuǎn)換酶(1O86)的結(jié)合位點(diǎn)，利用AdmetSAR和ToxinPred對(duì)其理化特性、代謝、安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，隨后開(kāi)展環(huán)境穩(wěn)定性研究，以期為后續(xù)結(jié)構(gòu)修飾與應(yīng)用提供理論參考，推動(dòng)雙活性肽構(gòu)效關(guān)系研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-S-triazine, TPTZ)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物(N-Hippuryl-His-Leu hydrate, HHL)、ACE、鄰苯二甲醛(O-phthaldialdehyde, OPA)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；超濾膜UE003(截留分子質(zhì)量3000 Da)、反滲透膜RO4，中科瑞陽(yáng)膜技術(shù)有限公司；其他試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL20M-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；Infinite M酶標(biāo)儀，瑞士Tecan集團(tuán)有限公司；UV-6300雙光束型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；XS205電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；LC-500型制備液相，杭州旭昱有限公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芝麻活性肽QCKH分離純化與鑒定

低溫芝麻餅粕采用索氏抽提脫油(溶劑為沸程30～60 ℃石油醚)后，按照袁東振等[13]方法從低溫芝麻餅粕制備芝麻蛋白，參考周存山等[14]方法進(jìn)行體外模擬消化，中和酶解液，冷卻室溫后，8 000 r/min離心30 min，取上清液采用UE003膜過(guò)濾，透過(guò)液隨即利用反滲透膜RO4濃縮，采用LC-500制備液相分離并采用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[11]，獲得QCKH，其含量為0.037 2%。經(jīng)蛋白質(zhì)信息庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)該肽段是芝麻7S globulin (ID：Q9AUD0_SESIN)中的DPELKQCKHQCKAQ 32～35的片段。

1.3.2 多肽設(shè)計(jì)與合成

為揭示QCKH的活性中心與構(gòu)效關(guān)系，將該多肽分成2個(gè)區(qū)域：N端和C端，設(shè)計(jì)QC和KH，比較抗氧化與降血壓活性，初步確立活性中心位置。隨后在控制肽鏈長(zhǎng)度的前提下，考察N末端、C末端、C端第2位氨基酸類(lèi)型對(duì)活性影響，設(shè)計(jì)下面多肽SCKH、ACKH、FCKH、RCKH、ECKH、QCKR、QCKE、QCKD、QCDH、QCEH、QCED、QCIV，并固態(tài)合成(無(wú)錫亞肽公司合成)，純度為95%。

1.3.3 構(gòu)效關(guān)系建模

采用SYBYL-X軟件中protein building模塊將1.3.2中的多肽錄入軟件，多肽電荷模式采用MMFF94模擬，能量?jī)?yōu)化采用MMFF94力場(chǎng)的Powell共軛梯度算法(最大運(yùn)算次數(shù)為10 000，能量?jī)?yōu)化終止標(biāo)準(zhǔn)0.000 5 kcal/mol ?)[11]。分別采用ACE抑制活性最高的SCKH、DPPH自由基清除能力最高的QCIV、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最高的QCKH為模板，C為骨架，構(gòu)建CoMSIA模型，分子疊加圖見(jiàn)圖1。偏最小二乘法(partial least squares,PLS)和留一法交叉驗(yàn)證程序(leave-one-out cross validation,LOO)對(duì)構(gòu)效模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，模型成立的標(biāo)準(zhǔn)是：交叉驗(yàn)證系數(shù)(Q2)>0.5，誤差預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差(R2)>0.6[15]。

圖1 QCKH及其衍生肽分子疊加圖Fig.1 Structural alignment of QCKH and derived peptides

1.3.4 分子拼接

為揭示QCKH抑制ACE活性的途徑，通過(guò)分子拼接軟件Molecular Operating Environment 2015 (MOE 2015)分析QCKH與人體血管緊張素蛋白轉(zhuǎn)換酶中氨基酸殘基結(jié)合情況。從RCSB PDB網(wǎng)站(https://www.rcsb.org/structure/1O86)下載含有賴諾普利的人體血管緊張素蛋白轉(zhuǎn)換酶的PDB文件,導(dǎo)入MOE 2015軟件，質(zhì)子化后，除去水分子，作為模板，打開(kāi)MOE 2015中Dock模塊，將QCKH作為配體載入，拼接方法設(shè)置為Proxy Triangle，優(yōu)化設(shè)置為Rigid Receptor，得分方式選用London dG和GBV/WSA dG，從30個(gè)構(gòu)型中選取5個(gè)最佳構(gòu)型[16]。

1.3.5 QCKH生理活性與安全性預(yù)測(cè)

QCKH的生理活性采用AdmetSAR2.0 (http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)預(yù)測(cè)，選取人體腸道吸收(human intestinal absorption，HIA)和人體口服生物利用度(human oral bioavailability，HOB)表征吸收特性，選取血腦屏障(blood-brain barrier penetration，BBB)、血漿蛋白結(jié)合率(plasma protein binding，PPB)、P-糖蛋白底物與抑制劑來(lái)表征分布特性，選取細(xì)胞色素450(cytochrome P450，CYP)底物與抑制活性表征代謝特性，選取致癌性和急性經(jīng)口毒性表征毒性[17]。此外，對(duì)毒性及理化特性還采用ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in /raghava/toxinpred/design.php)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)方法基于Swiss-Prot[18]。

1.3.6 QCKH穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.6.1 熱穩(wěn)定試驗(yàn)

將QCKH配制成2 mg/mL的測(cè)試液，分別置于30、40、50、60、70、80、90和100 ℃水浴加熱3 h，冷卻至室溫，測(cè)定DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、ACE抑制率。

1.3.6.2 酸、堿穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制2 mg/mL QCKH溶液，分別調(diào)節(jié)pH為2、4、6、8、10和12，在20 ℃靜置3 h，測(cè)定其DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、ACE抑制率。

1.3.6.3 紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制2.0 mg/mL的QCKH溶液，置于15 W紫外燈(257 nm)下10 cm處，室溫下照射48 h，每隔4 h，測(cè)定其DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、ACE抑制率[19]。

1.3.7 抗氧化活性測(cè)定

采用DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基自由基清除率來(lái)評(píng)價(jià)多肽抗氧化活性，參照LU等[11]的方法，測(cè)定多肽溶液的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率，利用SPSS 25中probit模塊計(jì)算IC50，即自由基清除率達(dá)到50%對(duì)應(yīng)的多肽濃度。

1.3.8 ACE抑制活性測(cè)定

參考LI等[20]的方法，取20 μL的多肽溶液與40 μL ACE(12.5 mU/mL)和40 μL 4.66 mmol/L HHL溶液(0.4 mmol/L pH 8.5磷酸緩沖液含0.6 mol/L NaCl)混合，在37 ℃反應(yīng)1 h后，加入150 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，再加入40 μL體積分?jǐn)?shù) 2%的OPA甲醇溶液室溫反應(yīng)20 min，隨后加入40 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液按體積比1∶15 加入蒸餾水稀釋后，倒入熒光比色皿，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)455 nm，狹縫寬度5 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。按照公式(1)計(jì)算ACE抑制率：

(1)

式中：a,含有多肽、ACE和HHL溶液的熒光強(qiáng)度;b,ACE和HHL溶液的熒光強(qiáng)度;c,多肽和HHL溶液的熒光強(qiáng)度;d,HHL溶液的熒光強(qiáng)度。

測(cè)定系列多肽濃度對(duì)應(yīng)的ACE抑制率采用SPSS 25中probit計(jì)算IC50，即抑制ACE活性50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的多肽濃度。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

無(wú)特殊說(shuō)明，所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次。單因素方差分析由SPSS 25(Duncan算法)運(yùn)算，顯著水平0.05，高度顯著水平0.01。同一曲線上帶有相同小寫(xiě)字母的數(shù)據(jù)間在0.05水平無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 QCKH構(gòu)效關(guān)系

為驗(yàn)證上述推測(cè)，合成QC與KH并檢測(cè)活性，結(jié)果顯示QC與KH均有ACE抑制與抗氧化活性，這表明以上2種多肽片段均對(duì)QCKH的活性有貢獻(xiàn)(表1)。相較于QCKH的ACE抑制活性與抗氧化活性，QC與KH的抗氧化活性均弱于QCKH，上述結(jié)果說(shuō)明QC與KH結(jié)合形成QCKH的空間結(jié)構(gòu)與電荷分布提升了抗氧化活性。

表1 QCKH及衍生多肽的ACE抑制與抗氧化活性Table 1 ACE-inhibitory and antioxidant activities of peptides derived from QCKH

根據(jù)Q2和R2，基于ACE抑制活性與DPPH自由基清除能力構(gòu)建的QCKH的CoMSIA模型成立，而基于ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力構(gòu)建的CoMSIA模型的Q2值與0.5接近，其準(zhǔn)確性較差，故不予考慮(表2)。

表2 QCKH降壓與抗氧化的CoMSIA模型Table 2 CoMSIA models for ACE-inhibitory and antioxidation of QCKH

分析結(jié)構(gòu)因素對(duì)降壓與抗氧化的影響發(fā)現(xiàn)，氫鍵是影響QCKH降壓與抗氧化活性的首要因素，該結(jié)果與管驍?shù)萚27]研究結(jié)果部分相符。推測(cè)QCKH中氨基酸殘基通過(guò)氫鍵與ACE的活性位點(diǎn)結(jié)合，改變其空間結(jié)構(gòu)，造成ACE難以與人體血管緊張素1結(jié)合，起到抑制作用。同時(shí)，QCKH的氨基酸殘基經(jīng)氫鍵與自由基連接，通過(guò)共振穩(wěn)定自由基結(jié)構(gòu)，起到抗氧化作用[28]。電荷極性對(duì)QCKH的ACE抑制影響大于DPPH自由基清除，這可能是多肽的電荷極性會(huì)影響與ACE活性中心Zn2+結(jié)合，導(dǎo)致在ACE抑制活性上產(chǎn)生差異[29]。QCKH及其衍生肽均是4肽，分子尺寸較小，易于進(jìn)入ACE與其活性位點(diǎn)結(jié)合，同時(shí)，由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，活性基團(tuán)暴露，易于DPPH自由基結(jié)合，導(dǎo)致QCKH空間位阻的影響較低。

QCKH的氨基酸殘基通過(guò)氫鍵、電荷極性、疏水作用、空間位阻對(duì)ACE抑制活性與DPPH自由基清除能力的影響見(jiàn)圖2～圖6。在圖2中，氫鍵供體在綠色區(qū)域有利于提高ACE抑制活性與抗氧化活性，而氫鍵供體在紅色區(qū)域不利于提高活性，由此推知，C末端氨基酸殘基側(cè)鏈被氫鍵供體基團(tuán)取代可以提高ACE抑制(圖2-a)，這可能是QCKH的ACE抑制活性強(qiáng)于QCKE的原因，QCKE中Glu4的側(cè)鏈上羰基是氫鍵受體，QCKH中His4側(cè)鏈為咪唑基是氫鍵供體。在N端氨基酸殘基側(cè)鏈頂端有氫鍵供體，有利于提高DPPH自由基清除能力，這與DPPH自由基中氫鍵受體硝基有關(guān)。通過(guò)分子間氫鍵，多肽能更加穩(wěn)定與DPPH連接，為后續(xù)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移提供有利條件。

a-氫鍵供體對(duì)ACE抑制活性影響;b-氫鍵供體對(duì)DPPH自由基清除影響圖2 CoMSIA模型中氫鍵供體對(duì)QCKH的活性影響Fig.2 Effect of hydrogen bond donor on activities of QCKH in CoMSIA model

在圖3中，氫鍵受體在綠色區(qū)域有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除活性，反之，在紅色區(qū)域不利于ACE抑制和DPPH自由基清除活性。C末端羧基中羰基對(duì)于提升QCKH的ACE抑制活性起到重要作用(圖3-a)。

a-氫鍵受體對(duì)ACE抑制活性影響;b-氫鍵受體對(duì) DPPH自由基清除影響圖3 CoMSIA模型中氫鍵受體對(duì)QCKH的活性影響Fig.3 Effect of hydrogen bond acceptor on activities of QCKH in CoMSIA model

若要提高多肽的ACE抑制和DPPH自由基清除活性，綠色區(qū)域適宜帶正電荷取代基，紅色區(qū)域適宜帶負(fù)電取代基。由圖4可知，C端氨基酸的羧基被帶正電基團(tuán)取代會(huì)提高ACE抑制活性，推測(cè)通過(guò)陽(yáng)離子-π相互作用，影響ACE中His383和Tyr523，增加抑制效果[30]。對(duì)于QCKH的抗氧化活性而言，Lys3側(cè)鏈帶正電荷是有利因素(圖4-b)，這可能是在電荷斥力的作用下，使缺電子帶正電的自由基避開(kāi)上述基團(tuán)，接近Cys2的巰基，加速反應(yīng)進(jìn)行，顯示更強(qiáng)的抗氧化能力。QCKH的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于QCDH也證實(shí)上述結(jié)論。

a-電荷極性對(duì)ACE抑制活性影響; b-電荷極性對(duì)DPPH自由基清除影響圖4 CoMSIA模型中電荷極性對(duì)QCKH的活性影響Fig.4 Effect of electrostatic field on activities of QCKH in CoMSIA model

圖5中，疏水基團(tuán)出現(xiàn)在綠色區(qū)域內(nèi)有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除活性，反之，在紅色區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)會(huì)降低ACE抑制和DPPH自由基清除活性。由圖5可知，N端和Lys3氨基酸殘基側(cè)鏈頂端含有疏水氨基酸有利于增強(qiáng)ACE抑制活性，這同前人報(bào)道N端為疏水性芳香氨基酸的ACE抑制肽活性較高的結(jié)論部分一致[31]。N端氨基酸殘基的α-C附近區(qū)域?yàn)槭杷鶊F(tuán)有利于提升抗氧化活性，這可能是DPPH自由基為非極性自由基，當(dāng)多肽N端有疏水基團(tuán)時(shí)，更有利于兩者通過(guò)疏水相互作用靠近，增加Cys2與DPPH反應(yīng)機(jī)率。

a-疏水作用對(duì)ACE抑制活性影響;b-疏水作用對(duì)DPPH 自由基清除影響圖5 CoMSIA模型中疏水作用對(duì)QCKH的活性影響Fig.5 Effect of hydrophobicity on activities of QCKH in CoMSIA model

圖6中，小體積取代基出現(xiàn)在紅色區(qū)域、大體積取代基出現(xiàn)在綠色區(qū)域都有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除能力。由圖6-a可知，增加C端氨基酸殘基體積，有利于提高ACE抑制活性。上述結(jié)論同UDENIGWE等[32]報(bào)道C端為大側(cè)鏈氨基酸的ACE抑制肽有較高活性的結(jié)論一致。適當(dāng)減少N端氨基酸氨基體積，更容易暴露Cys2的巰基基團(tuán)，有利于提高多肽DPPH自由基清除能力(圖6-b)。

a-空間位阻對(duì)ACE抑制活性影響;b-空間位阻對(duì)DPPH自由基清除影響圖6 CoMSIA模型中空間位阻對(duì)QCKH的活性影響Fig.6 Effect of steric field on activities of QCKH in CoMSIA model

2.2 QCKH的分子拼接

由圖7-a可知，QCKH與降血壓藥物賴諾普利在ACE中的位置基本吻合。由圖7-b可知，QCKH通過(guò)氫鍵與ACE上的Tyr520、Gln281、Lys511、His513、His353、Tyr523、Ala354、Ala356和Glu411結(jié)合，通過(guò)離子鍵同His387、Lys511、His353和Zn701結(jié)合，還通過(guò)芳烴鍵與Phe457、His353發(fā)生作用。前人報(bào)道，ACE催化活性受活性口袋S1(Ala354、Glu384、Tyr523)、S2(Gln281、His353、Lys511、His513、Tyr520)、S1′(Glu162)和活性中心Zn2+(His383、His387和Glu411)的影響[33]。由此可知，QCKH主要通過(guò)影響ACE活性口袋S1、S2和Zn2+的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)ACE的抑制。His4的羧基作為氫鍵受體同Gln281，Tyr520，Phe512，Lys511發(fā)生作用，驗(yàn)證了2.1構(gòu)效關(guān)系分析中C端適宜由氫鍵受體構(gòu)成的結(jié)論。

a-空間拼接圖(藍(lán)色分子為QCKH，綠色分子為賴諾普利); b-平面拼接圖圖7 QCKH與ACE分子拼接圖Fig.7 Molecular docking for QCKH and ACE

2.3 QCKH生理活性與安全性預(yù)測(cè)

活性肽在體內(nèi)產(chǎn)生有益功能，必須能被肌體吸收、輸送與代謝，同時(shí)，還有低的毒副作用。因此，有必要評(píng)價(jià)QCKH的生理活性與安全性。由表3所示，QCKH可以經(jīng)口吸收；在血液中，與血漿蛋白結(jié)合率低，這表明QCKH在血液中較穩(wěn)定，有利于藥效發(fā)揮；高血腦屏障、非細(xì)胞色素P450酶系底物(除CYP3A4)、無(wú)抑制細(xì)胞色素P450活性，這表明QCKH既不影響中樞神經(jīng)，也不干擾正常的細(xì)胞活動(dòng)；QCKH預(yù)測(cè)無(wú)致癌性與無(wú)毒性，安全性高。上述結(jié)果表明，QCKH可以作為功能因子應(yīng)用于保健食品。然而，基于Lipinski類(lèi)藥五原則，QCKH氫鍵受體和可旋轉(zhuǎn)鍵偏多，且脂水分配系數(shù)偏低，需要分子修飾以簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)和提高脂溶性。

表3 QCKH生理活性、理化特性與安全性預(yù)測(cè)Table 3 Prediction on physiological activity, physicoch- emical properties and safety of QCKH

2.4 QCKH的環(huán)境穩(wěn)定性

由圖8可知，溫度會(huì)顯著影響QCKH的活性，其中對(duì)于抗氧化活性的影響要大于降壓活性的影響。隨著加熱溫度升高，QCKH的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力迅速下降，而降壓活性下降較為平緩。產(chǎn)生上述變化的原因可能是QCKH的抗氧化活性主要受Cys2的影響，隨著溫度上升，性質(zhì)活潑的巰基更易氧化脫氫，同時(shí)，還會(huì)形成分子間二硫鍵，從而降低抗氧化活性[34]。雖然QCKH的降壓活性與巰基無(wú)關(guān)，但通過(guò)二硫鍵連接的二聚體，改變?cè)械目臻g結(jié)構(gòu)并增加體積，從而削弱與ACE結(jié)合的能力，導(dǎo)致ACE抑制活性下降。

圖8 溫度對(duì)QCKH活性的影響Fig.8 Effect of temperature on activities of QCKH

pH對(duì)QCKH活性影響的見(jiàn)圖9。當(dāng)pH<6時(shí)，QCKH的抗氧活性無(wú)顯著差異，進(jìn)入堿性環(huán)境時(shí)，QCKH的抗氧化活性顯著下降。這可能是一方面QCKH在堿性條件下，發(fā)生消旋，從而引起肽鏈構(gòu)象發(fā)生改變，影響活性[35]；另一方面，QCKH中Cys2巰基發(fā)生解離，從而降低活性[36]。與抗氧化活性不同，QCKH的ACE抑制活性在pH 8達(dá)到最強(qiáng)，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能與QCKH的等電點(diǎn)有關(guān)，QCKH的等電點(diǎn)為8.57，在pH為8時(shí)，大部分QCKH中His羧基為負(fù)電荷，由2.2小節(jié)可知，這有利于QCKH抑制ACE活性，然而，隨著pH的繼續(xù)升高，Gln1的氨基失氫，不能作為氫鍵供體，減弱與ACE結(jié)合能力，從而降低ACE抑制活性；加之，堿性導(dǎo)致肽鏈消旋，改變空間結(jié)構(gòu)，也影響ACE抑制活性。

圖9 pH對(duì)QCKH的影響Fig.9 Effect of pH on activities of QCKH

紫外照射對(duì)QCKH的活性影響見(jiàn)圖10。隨著紫外照射時(shí)間延長(zhǎng)，QCKH的ACE抑制活性與抗氧化活性均顯著下降。紫外線作用導(dǎo)致多肽外層電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)狀態(tài)，導(dǎo)致羥基、巰基、氨基上的氫發(fā)生電離，從而改變?cè)薪Y(jié)構(gòu)，影響活性[37]。此外，紫外線照射導(dǎo)致水分子裂解產(chǎn)生羥自由基[19]，也會(huì)加速Q(mào)CKH抗氧化能力的消耗，從而導(dǎo)致出現(xiàn)抗氧化活性下降大于ACE抑制活性現(xiàn)象。

圖10 UV照射對(duì)QCKH的影響Fig.10 Effect of UV on activities of QCKH

3 結(jié)論

綜上所述，QCKH的抗氧化與降血壓活性與Cys2和His4有關(guān)，經(jīng)CoMSIA建模發(fā)現(xiàn)，QCKH的抗氧化與降血壓活性主要受氫鍵、電荷極性、疏水作用影響。QCKH通過(guò)氫鍵與離子鍵與ACE的活性口袋S1和S2、活性中心Zn2+發(fā)生作用，改變ACE空間結(jié)構(gòu)，起到抑制ACE活性的作用。ADMET預(yù)測(cè)QCKH可以經(jīng)口吸收，不會(huì)干擾人體正常的生理活動(dòng)，安全性高。分析環(huán)境因素影響發(fā)現(xiàn)，在常溫、中性、避光條件下，QCKH的抗氧化與降血壓活性基本穩(wěn)定，且在環(huán)境因素作用時(shí)，QCKH降血壓活性比抗氧化活性穩(wěn)定。

在后續(xù)研究中，QCKH應(yīng)通過(guò)分子修飾，以達(dá)到簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)、提高脂溶性、改善腸道吸收能力；在加工過(guò)程中，應(yīng)避免高溫、極端pH與光照，以減少損耗。