劉金星　況薇

【摘 ?要】目的：針對同一病人的石蠟組織PCR結(jié)果不同的現(xiàn)象，分析可能出現(xiàn)的原因及應(yīng)對措施。方法：采用雙盲翻倍實驗方法，對兩組PCR結(jié)果進行分析。結(jié)果：A、B兩組實驗結(jié)果顯示2張（±）、4張（+）、8張（+）。結(jié)論：石蠟取材準(zhǔn)確與否，直接影響PCR擴增結(jié)果準(zhǔn)確性，為避免結(jié)果不一致，需先鏡下定位取材部位，裝管的石蠟組織片厚度為5微米，數(shù)量以大于兩張為宜。

【關(guān)鍵詞】石蠟;HPV檢測

【中圖分類號】R737 ?????【文獻標(biāo)識碼】A ?????【文章編號】1672-3783（2020）06-0292-01

以宮頸癌為代表的宮頸病變是一種發(fā)病率較高的婦科疾病，是威脅婦女健康的最為嚴(yán)重的疾病之一，90%的宮頸癌是由人乳頭瘤狀病毒持續(xù)感染引起[1-3]，發(fā)病率近十年來持續(xù)上升并趨于年輕化，目前，HPV分型的檢測方法主要有雜交法和以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的兩大類，我們采用PCR體外擴增和DNA反向點雜交相結(jié)合的HPV基因分型檢測技術(shù)，對同一患者的宮頸石蠟組織進行雙盲翻倍實驗，對實驗結(jié)果進行分析，旨在討論出現(xiàn)結(jié)果不同的原因及解決方法。

1 材料與方法

1.1 材料 ?leica石蠟切片機、刀片、鑷子、75%酒精、醫(yī)用棉簽、1mlEP管、記號筆、待檢石蠟組織塊、裂解液、金屬浴、離心機（13000r/min）、加樣槍（1-10ul/10-1000ul）、PCR擴增儀、膜條、PCR雜交儀、自備試劑20×SSC（175.3gNacl、88.2g檸檬酸鈉，加蒸餾水800ml溶解，用濃鹽酸調(diào)PH值至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌保存）、10%SDS（20gSDS加蒸餾水180ml溶解，用1N HCL調(diào)制PH7.0，定容至200ml）、1M檸檬酸鈉（294.1g檸檬酸鈉加蒸餾水700ml溶解，用濃HCL調(diào)制PH5.0，定容至1000ml）、A液（100ml 20×SSC，10ml10%SDS加純化水定容至1000ml，常溫保存）、B液（25ml20×SSC，10ml10%SDS加純化水定容至1000ml，常溫保存）、C液（100ml 1M檸檬酸鈉加純化水定容至1000ml，常溫保存）、顯色液（19ml C液加入1mlTMB和1ul30%H2O2）等。

1.2 方法 鏡下觀察該患者大體HE切片，篩選出有細胞癌變的蠟塊，由A、B兩組實驗人員分別以5um厚度，數(shù)量2張、4張、8張的方法裝管取樣。具體操作如下，實驗人員佩戴口罩、帽子及醫(yī)用手套，將待檢蠟塊修至最大切面后，用棉簽蘸75%酒精擦拭切片刀兩側(cè)、刀座及石蠟組織切面，防止外源性生物污染，丟棄第一張組織切片，因為組織表面被酒精沾染，裝管應(yīng)避免酒精對后續(xù)實驗的干擾，用無菌鑷子選取2張、4張、8張組織片數(shù)分別裝管標(biāo)號備用，操作全程均應(yīng)遵循無菌原則。將裝有組織的EP管分別加入200ul裂解液，放入金屬浴煮沸15min，然后離心5min，EP管內(nèi)出現(xiàn)3層，上層石蠟、中間DNA懸液、下層待檢組織碎屑，如圖1，選取中間懸液5ul加入擴增樣品管，震蕩均勻后離心數(shù)秒，防止反應(yīng)液貼壁，放入PCR擴增儀，擴增2h36min后，變性10min進行雜交顯色，雜交流程：A液與膜條預(yù)熱后加樣，搖床45min→B液洗膜10min→A液+POD孵育30min→A液洗膜5min兩次→C液洗膜5min兩次→顯色液10min→水洗。

2 結(jié)果

經(jīng)過雙盲翻倍實驗方法，得出A組顯色結(jié)果：2張（±）、4張（+）、8張（+），且陽性型號相同，實驗?zāi)l內(nèi)參IC均顯示，但2張內(nèi)參比后兩組稍弱，B組顯色結(jié)果：2張（-）、4張（+）、8張（+），陽性型號相同，實驗?zāi)l內(nèi)參IC均顯示，如圖2。

3結(jié)論

本試驗操作簡單，獲取DNA樣本充足，用酒精消毒避免組織污染方法有效且節(jié)省了耗材，對出現(xiàn)不同結(jié)果的原因，分析有以下幾點：

①組織取樣不到位，即目標(biāo)細胞過少，從實驗結(jié)果可以看出，2張（-）且內(nèi)參信號弱，在取材時可選取3-5張組織切片為宜;

②切片總面積的增加其表面黏附的PCR抑制因子將可能增多，為避免過多組織干擾，我們可選取目標(biāo)組織定位取材，切片厚度固定5um;

③甲醛除本身可造成DNA分子損傷外，其與氧化性物質(zhì)接觸后形成的甲酸改變環(huán)境PH從而影響DNA分子穩(wěn)定性，使核酸中嘌呤基的β糖苷鍵容易發(fā)生水解而導(dǎo)致DNA鏈斷裂[9]，提取目的DNA時會造成干擾，我們應(yīng)避免使用存放過久的石蠟塊進行實驗;

④加樣時DNA量不足導(dǎo)致擴增失敗，在加樣時，應(yīng)將槍頭沿EP管壁輕輕插入，破石蠟層后吸取DNA懸液;

⑤當(dāng)感染多種HPV病毒時，由于HPV可檢出期比較短，大部分婦女HPV感染期比較短，一般在8-10個月便會消失，有約10%-15%的35歲以上女性有持續(xù)感染情況，這些人有更高的患癌風(fēng)險，在檢測HPV分型時，會出現(xiàn)多次檢查分型不同的情況。

⑥經(jīng)研究表明，HPV致癌作用與HPV DNA的整合有關(guān)，宮頸鱗狀上皮與柱狀上皮連接處是HPV的易感部位，HPV感染宿主細胞后，會以兩種形式存在于宿主細胞中，即細胞染色體的整合狀態(tài)和染色體的游離狀態(tài)，而宮頸癌中絕大部分病毒以整合狀態(tài)存在，浸潤性宮頸癌中，則兩種狀態(tài)共存，但通過鏡下觀察，癌細胞的分布并不均勻，在進行取樣時，還應(yīng)鏡下先選取病變部位，再行裝管實驗，當(dāng)取材不充分時，同一組織塊會檢測出不同結(jié)果的現(xiàn)象，是由于病毒的分布并不均勻。

4總結(jié)

通過本例實驗，我們得知影響實驗結(jié)果的主要原因及眾多干擾因素中，組織取材不到位，很大程度上影響實驗的結(jié)果，也通過查找相關(guān)文獻得以輔證，為避免實驗結(jié)果的差異性，取材前篩片選塊，裝管組織厚度5um，張數(shù)大于2張，小于8張為宜，避免組織浪費。

參考文獻

[1] 陳曄， 顧蕓， 耿建祥，等. 宮頸鱗癌組織中HPV感染型別分布情況的分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志， 2019（16）.

[2] 賀仁娟， 趙敏. HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變中應(yīng)用價值的探討[J]. 實用婦科內(nèi)分泌雜志（電子版）， 2018（1）.

[3] 徐來祥，張知彬，宋銘晶，等.福爾馬林保存的動物標(biāo)本基因組DNA的提取方法[J].動物學(xué)報，2004，48（2）：264-269.