林劍峰，白建陽，吳理文 ，張海華

（1.松陽縣科學技術局，浙江松陽 323400；2.松陽縣建陽茶葉有限公司，浙江松陽 323400；3.浙江正德和食品有限公司，浙江松陽 323400；4.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

茶葉是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品，近十年，我國茶產(chǎn)業(yè)規(guī)模（產(chǎn)量、面積、農(nóng)業(yè)產(chǎn)值）穩(wěn)居世界首位，茶葉產(chǎn)量從134 萬噸增長至279 萬噸， 茶園面積從186 萬公頃增長至306 萬公頃， 農(nóng)業(yè)產(chǎn)值從413億元增長至2396 億元[1-2]，發(fā)展勢頭良好。 另一方面， 茶資源供過于求的差距不斷增大， 主要表現(xiàn)在：干毛茶供過于求差額達30 余萬噸，占比50%以上的夏秋茶的利用率低、棄采嚴重，加之茶園荒棄等現(xiàn)象時有發(fā)生，導致茶葉、茶花、茶籽（果）、茶枝條等能用卻未用資源總量逾400 萬噸。 中國茶產(chǎn)業(yè)總體表現(xiàn)出茶資源供過于求的差距不斷增大的趨勢、質(zhì)量效益亟待提高的突出瓶頸[3-5]。 基于此， 文章著重開展外源酶對以夏秋茶鮮葉為原料加工的紅茶的品質(zhì)影響研究，旨在探索利用閑置、棄采夏秋茶資源， 希望通過外源酶調(diào)控小葉種紅茶品質(zhì)。

以小葉種茶樹鮮葉為原料加工制作紅茶的工藝及產(chǎn)品已相當成熟，如浙江杭州市的九曲紅梅、觀音紅等[6-8]。現(xiàn)有這類產(chǎn)品多采用春季茶鮮葉，而對小葉種茶樹的夏秋季鮮葉加工制作紅茶的加工技術和產(chǎn)品尚顯不足。少量研究報道表明，外源添加食品酶制劑能夠改善茶葉加工或深加工的效果。目前相關研究主要集中在兩方面：一是將外源酶用于茶葉深加工（速溶茶、茶飲料）的前處理，主要有單寧酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶，能夠增加浸出物含量，提高速溶茶的冷溶性，進而改善速溶茶或茶飲料的品質(zhì)[9-11]；二是將外源酶用于紅茶加工中，在發(fā)酵時添加外源酶（單寧酶、纖維素酶和多酚氧化酶），能夠縮短發(fā)酵時間，改善紅茶品質(zhì)，如蘇祝成等[12]利用外源單寧酶改善了夏茶滋味品質(zhì)成分和組成、包先進等[13]在磚茶加工中加入纖維素酶對微生物發(fā)酵進行部分替代而促進了磚茶品質(zhì)的形成。文章突破前人研究思路，以小葉種茶樹夏秋鮮葉為原料， 探索在紅茶揉捻工序加入外源酶， 研究外源酶對紅茶主要內(nèi)質(zhì)成分的影響，為紅茶品質(zhì)研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為2016 年9 月采自浙江松陽縣赤壽鄉(xiāng)婁塘村茶園白葉1 號茶樹品種一芽一二葉。

纖維素酶（EC3.2.1.4，20000 U/mL）：諾維信生物技術有限公司 （中國上海）； 木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2，50000 U/g）：廣西南寧東恒華道生物科技有限公司；單寧酶（EC 3.1.1.20，500 U/g）：江西百盈生物科技有限公司。兒茶素標品：上海源葉生物科技有限公司；茶黃素標品：Sigma-Aldrich 有限公司；乙腈（色譜純）、蒽酮、乙醇等化學分析試劑：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YF-6CWD-6 型紅茶萎凋槽： 安溪縣永鋒機械有限公司；6CSW-100 搖青機、6CR-35 茶葉揉捻機：浙江上洋機械有限公司；干燥箱：上海印溪儀器儀表有限公司。 ME4001 型電子天平： 梅特勒-托利儀器有限公司；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋、HG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；1525 型高效液相色譜儀：美國 Waters 公 司 ；5424R 型 高 速 離 心 機 ： 德 國Eppendorf 公司；UV-2102PC 型紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；LRH-70 型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 加工實驗方法

紅茶加工技術路線為萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥、提香，在揉捻過程中加入食品酶制劑。

加工流程為將當日采摘的夏秋鮮葉均勻攤放于萎凋槽中，攤葉厚度15 cm，環(huán)境溫度30 ℃、環(huán)境濕度80%～86%下自然萎凋21 h，獲得適宜揉捻的萎凋葉。 取等量2 kg 萎凋葉進行揉捻和發(fā)酵試驗， 設置揉捻和發(fā)酵實驗條件為環(huán)境溫度25 ℃、環(huán)境濕度88%，輕壓揉捻（20 min）→中壓揉捻（60 min）→發(fā)酵（28 ℃，8 h）。 酶制劑添加量實驗安排見表1。 干燥和提香參數(shù)根據(jù)實際生產(chǎn)經(jīng)驗，確定干燥參數(shù)先 110 ℃、55 min， 再 70 ℃、120 min，提香參數(shù) 120 ℃、35 min。

表1 外源酶應用實驗安排Table 1 Test design of the addition of exogenous enzymes

1.4 紅茶品質(zhì)分析方法

對紅茶樣品進行品質(zhì)成分分析， 主要分析水浸出物、茶多酚、可溶性糖、咖啡堿、兒茶素、茶黃素、茶氨酸的含量，以此探討外源酶對紅茶內(nèi)質(zhì)成分的影響。 含水率的測定參照GB/T 8304—2013《茶 水分測定》； 水浸出物的測定參照 GB/T 8305—2013《茶 水浸出物含量測定》；咖啡堿含量的測定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》；茶多酚和兒茶素含量測定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；茶氨酸含量測定參照GB/T 23193—2017《茶葉中茶氨酸的測定 高效液相色譜法》；茶黃素含量測定參照GB/T 30483—2013 《茶葉中茶黃素的測定高效液相色譜法》； 可溶性糖測定采用蒽酮-硫酸比色法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和圖表繪制采用WPS OFFICE EXCEL 2007。 每個實驗重復3 次，最終數(shù)據(jù)取平均值表示。

2 結果與分析

2.1 水浸出物含量

從圖1 可以看出， 加酶樣品的水浸出物含量均高于對照樣， 說明加酶能夠增加茶葉的水浸出物含量， 以及酶將茶葉中水不溶性組分經(jīng)酶解作用實現(xiàn)部分可溶。 對樣品進行排序：對照＜單寧酶01#＜單寧酶02#＜單寧酶03#＜蛋白酶03#＜蛋白酶01#＜蛋白酶+單寧酶＜纖維素酶01#＜蛋白酶02#＜纖維素酶02#＜纖維素酶03#＜蛋白酶+纖維酶＜三種酶混合＜單寧酶+纖維酶。從排序結果來看，就三種酶單獨使用而言， 纖維素酶對于紅茶水浸出物含量的增加效果最好，其次是蛋白酶，最后是單寧酶，這與三種酶的自身特性和底物含量有關；就兩兩組合酶來說，單寧酶+纖維素酶最好，其次是蛋白酶+纖維素酶，最后是蛋白酶+單寧酶，且所測值高于單酶，說明雙酶間有協(xié)同增效作用。當三種酶同時應用時，其效果并未特別突出，與蛋白酶+纖維素酶、單寧酶+纖維素酶、纖維素03#相當。

圖1 紅茶樣水浸出物含量Fig.1 Water extract content of black tea samples

2.2 可溶性糖含量

從圖2 可知， 加酶可以顯著增加紅茶中可溶性糖含量， 增加幅度最低者蛋白酶02# 增加了59%， 增加幅度最高者纖維素酶 01# 增加了193%，這一結果從內(nèi)質(zhì)上支撐了紅茶滋味甜度的提高。對比加酶樣品，纖維素酶參與的樣品可溶性糖含量高，其次是單寧酶，最后是蛋白酶。 從雙酶樣品結果可知蛋白酶和單寧酶組合具有協(xié)同增效作用，而與纖維素酶組合呈降效作用。

2.3 多酚總量

多酚是茶葉中非常重要的品質(zhì)成分， 是多酚氧化酶作用的底物， 其氧化產(chǎn)物是紅茶中重要的內(nèi)質(zhì)成分茶紅素、茶黃素等。 如圖2 所示，實驗樣品的多酚總量主要介于11.12～17.46 g/100 g。與對照樣相比，除單寧酶01# 外，其余加酶樣品中多酚總量都高于對照樣。結合雙酶結果推斷，就單酶使用而言蛋白酶對于增加多酚總量作用最大， 就雙酶使用而言蛋白酶和纖維素酶具有協(xié)同增效作用。

2.4 咖啡堿含量

如圖2， 加酶后樣品中咖啡堿含量與對照相當，分布在4.64～5.70 g/100 g 之間，說明加酶對紅茶中咖啡堿的含量影響不大， 進一步推測茶葉中咖啡堿的存在受水不溶蛋白和纖維素等大分子影響較小， 或是與蛋白或纖維素之間結合態(tài)少的緣故。

圖2 紅茶樣茶多酚、可溶性糖和咖啡堿含量Fig.2 Content of tea polyphenols, suluble sugar and caffeine in black tea samples

2.5 茶氨酸含量

紅茶樣品中的茶氨酸含量分布在0.35～0.60 g/100 g 之間，加酶后樣品中纖維素酶01# 與對照相當，其余樣品茶氨酸含量均低于對照，且酶用量最大者降幅也最大，見圖3。 可能是因為酶解作用打破了茶葉細胞系統(tǒng)中物質(zhì)間固有的平衡， 使得L-茶氨酸暴露或游離出來，光照下引起不穩(wěn)定[15]。

2.6 茶黃素含量

茶黃素由多酚類及其衍生物氧化縮合而來，主要是由兒茶素中的 （-） 表沒食子兒茶素 （LEGC） 與 （-） 表沒食子兒茶素沒食子酸酯 （LEGCG） 縮合而成，TF-3-G （茶黃素-3-沒食子酸酯）、TF-3'-G（茶黃素-3'-沒食子酸酯）、TFDG（茶黃素-3,3-雙沒食子酸酯）和TF（茶黃素）是常見的可檢測的茶黃素單體。 紅茶中茶黃素類的含量一般為0.3%～1.5%，對紅茶品質(zhì)起著決定性作用。所有實驗樣中（圖4），以單寧酶+纖維素酶樣品的茶黃素總量最高為1.54 g/100 g，以單寧酶01# 最低0.53 g/100 g。 實驗樣品的茶黃素含量排序為：單寧酶 01#＜單寧酶 02#＜蛋白酶 02#＜蛋白酶01#＜單寧酶03#＜對照＜蛋白酶+單寧酶＜蛋白酶03#＜三種酶混合＜纖維素酶03#＜纖維素酶01#＜纖維素酶02#＜蛋白酶+纖維酶＜單寧酶+纖維酶。三種酶中纖維素酶對茶黃素具有增效作用， 單寧酶作用后茶黃素含量比對照低。 無論是蛋白酶還是單寧酶與纖維素組合，都表現(xiàn)出增效作用。

2.7 兒茶素含量

兒茶素是茶鮮葉中的特征性成分， 紅茶發(fā)酵工序將兒茶素通過非微生物作用的聚合、氧化、異構化等反應轉化為茶黃素或茶紅素等。 圖5，加酶后兒茶素總量都提高了60%以上， 加酶樣品中兒茶素總量最高者為單寧酶01# 和單寧酶+纖維素酶、最低者為三種酶混合樣品。 就單酶而言，從提高程度上排序為纖維素酶＞蛋白酶＞單寧酶。 無論蛋白酶還是單寧酶與纖維素酶組合使用， 提高幅度均不及纖維素酶或蛋白酶單獨使用。

圖3 紅茶樣茶氨酸含量Fig. 3 Content of theanine in black tea samples

圖4 紅茶樣中茶黃素含量Fig.4 Content of theaflavins in black tea samples

3 討論

縱觀上述紅茶的水浸出物、 茶多酚、 可溶性糖、咖啡堿、兒茶素、茶黃素、茶氨酸含量7 個主要品質(zhì)指標的變化，結合表2 木瓜蛋白酶、纖維素酶和單寧酶的作用機理和應用效果分析：（1）單寧酶通過水解多酚類化合物中酯鍵和縮酚酸鍵實現(xiàn)對茶葉中茶多酚、兒茶素總量及單體、茶黃素總量及單體的動態(tài)調(diào)控。 研究認為單寧酶能夠增加茶梗提取液中兒茶素的總量[16]，且公認單寧酶能夠轉溶“茶乳酪”（多酚類、咖啡堿、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過分子間氫鍵與疏水作用絡合而成），即通過水解切斷兒茶素復合物中的酯鍵， 解離出的沒食子酸又能與茶紅素、茶黃素競爭咖啡堿，形成分子量較小的水溶物，從而降低茶湯渾濁度[17]，F(xiàn)UKUDA 等[18]研究也認為單寧酶處理綠茶提取物能夠提高非聚合型兒茶素類濃度。綜合分析，認為在茶葉加工中使用單寧酶一方面可降解兒茶素復合體 （天然結合態(tài)茶多酚，加工中形成的茶乳酪等），另一方面對于兒茶素縮合產(chǎn)物的生成亦有一定影響。 夏秋鮮葉中因多酚、氨基酸等滋味物質(zhì)比例不協(xié)調(diào)，常出現(xiàn)苦澀味， 而單寧酶通過水解作用可動態(tài)調(diào)控多酚類（茶多酚、兒茶素、茶黃素）的轉化，進而改變呈味物質(zhì)的比例[19]。 （2）蛋白酶主要是對茶葉中的蛋白質(zhì)進行水解作用， 茶葉中蛋白質(zhì)含量一般在20%左右且多是水不溶蛋白， 蛋白酶對茶葉蛋白進行水解，產(chǎn)生肽段和部分氨基酸，增加了紅茶的水浸出物含量，同時釋放了多酚-蛋白復合物中的多酚類物質(zhì)[20]，進而增加了紅茶中多酚類物質(zhì)的含量，前人研究也發(fā)現(xiàn)在紅碎茶加工、紅茶發(fā)酵中添加蛋白酶， 均能夠增加茶黃素和氨基酸的含量，且此時多酚氧化酶活性可提高一倍，有效縮短發(fā)酵時間[21-23]。同時蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段及氨基酸類具有呈味作用[24]，從而能夠改變紅茶的呈味物質(zhì)組成及比例，最終影響紅茶茶湯的滋味。 （3）纖維素酶能夠水解茶葉細胞壁物質(zhì)，更快、更多的釋放細胞質(zhì)， 這為茶葉中固有的多酚氧化酶提供了更多的底物和酶促機會， 因此表現(xiàn)出添加纖維素酶的紅茶的多項品質(zhì)指標都有增高現(xiàn)象。

圖5 紅茶樣中兒茶素含量Fig.5 Content of catechins in black tea samples

表2 外源酶在茶葉加工中的作用機理[25]Table 2 Mechanism of exogenous enzymes in tea processing[25]

總體而言， 添加蛋白酶對于紅茶主要內(nèi)質(zhì)成分的增加具有較好的作用， 因此蛋白酶可優(yōu)選為紅茶加工用外源酶。纖維素酶，對于紅茶內(nèi)質(zhì)也有增加作用， 但是鑒于纖維素酶對細胞壁的水解作用，實驗中肉眼可見易出現(xiàn)葉張不完整、外形和葉底不勻、茶湯有葉渣等現(xiàn)象，這對纖維素酶的實際應用有所影響。