于松慧 ，劉璇 ，宋育林 ，蘇虹羊 ，李靜雯 ，李小超 ，陳玉瓊 ，倪德江，余志 *

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點試驗室，湖北武漢430070； 2.秭歸縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北秭歸 443600；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部華中都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，湖北武漢430070； 4.威泰克科學(xué)技術(shù)有限公司，北京100125）

植物導(dǎo)管是運輸水分和內(nèi)含物質(zhì)的重要通道，因其次生壁加厚方式的不同，分為螺紋導(dǎo)管、環(huán)紋導(dǎo)管、梯紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管以及孔紋導(dǎo)管[1]。不同植物中導(dǎo)管增厚方式有差異， 導(dǎo)管增厚結(jié)構(gòu)會影響水分的傳輸。陳琦等[2]通過建立導(dǎo)管內(nèi)壁增厚結(jié)構(gòu)的伯努利數(shù)學(xué)模型發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管內(nèi)徑、 增厚紋間距、紋高等對導(dǎo)管內(nèi)水分傳輸有顯著影響。導(dǎo)管微觀結(jié)構(gòu)決定功能[3]，導(dǎo)管數(shù)量、直徑等結(jié)構(gòu)特征決定導(dǎo)管輸導(dǎo)水分的能力。宋朝鵬等[4]對烘烤過程中煙葉的水分遷移特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)葉片主脈直徑的收縮與水分的散失密切相關(guān)。 導(dǎo)管直徑的輕微改變就會引起導(dǎo)水效率顯著變化[5-6]。 茶葉中的導(dǎo)管研究較少， 烏龍茶加工中導(dǎo)管本身的結(jié)構(gòu)成分變化與茶葉品質(zhì)之間的直接關(guān)系認(rèn)識尚不充分。烏龍茶加工的關(guān)鍵環(huán)節(jié)做青包含搖青與晾青兩道工序，二者交替進(jìn)行[7]。做青經(jīng)歷“走水還陽”過程，促進(jìn)茶葉中萜烯糖苷的水解， 增進(jìn)香氣的形成[8]。嫩莖中水分及內(nèi)含物質(zhì)通過導(dǎo)管運送至葉片中，被更充分地利用[9]。導(dǎo)管成分研究目前多采用將組織分離提取， 用傅立葉變換紅外光譜或高效液相法進(jìn)行檢測[10]。 這些方法通常難以保證樣品原生狀態(tài)。 而激光共聚焦拉曼成像技術(shù)具有較高的空間分辨率，無需進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，可以直接對樣品進(jìn)行無損、快速檢測[11]，將拉曼光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可視化圖像， 還能顯示出導(dǎo)管化學(xué)組成及成分分布變化信息。

研究以鐵觀音為材料， 用掃描電子顯微鏡和激光共聚焦拉曼成像技術(shù)直觀展現(xiàn)茶葉中導(dǎo)管存在的主要類型，分析莖、葉柄、葉片主脈的導(dǎo)管數(shù)量差異， 以及上述三個部位的導(dǎo)管形態(tài)和結(jié)構(gòu)成分在做青過程中的變化，豐富茶葉加工基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019 年8 月12 日， 選取華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶資源圃鐵觀音茶樹形成駐芽的一芽三葉為原料，按鐵觀音工藝進(jìn)行加工，具體流程如下：鮮葉、萎凋、做青、炒青、揉捻、干燥。 做青3 次，第一次搖青1 min，晾青 1 h；第二次搖青 3 min，晾青 3 h；第三次搖青 6 min，晾青 6 h。 搖青機(jī)轉(zhuǎn)速 25 r/min。 每一環(huán)節(jié)結(jié)束后分A、B 兩組進(jìn)行取樣，每組5 個重復(fù)：A 組對鮮葉、萎凋葉、三次搖青葉和晾青葉的三個部位進(jìn)行取樣（圖1），樣品長度為3～5 mm，供掃描電鏡測試；B 組對鮮葉、第三次晾青葉和炒青葉的部位3 進(jìn)行取樣， 樣品長度大約為1 cm，供激光共聚焦拉曼成像測試。 取樣部位如圖1 所示，部位1 為第二葉與第三葉之間莖的中間部位；部位2 為第二葉葉柄與莖的連接部位； 部位3 為第二葉葉片中間主脈部位。

圖1 鐵觀音鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)及取樣部位Fig. 1 Selection criteria and sampling sites of Tieguanyin fresh leaves

1.2 試驗儀器

試驗設(shè)備主要為：6CWL-85 型搖青機(jī) （福建佳友茶葉機(jī)械有限公司）、6CST-50 型滾筒殺青機(jī)（浙江綠峰機(jī)械有限公司）、 生物掃描電子顯微鏡（JSM-6390LV） 和激光共聚焦拉曼成像系統(tǒng)（WITec，Alpha 300R）。

1.3 試驗方法

1.3.1 掃描電鏡觀察導(dǎo)管形態(tài)

將A 組樣品迅速轉(zhuǎn)入2.5%成二醛溶液中固定，用梯度乙醇脫水，30%、50%、60%、70%和80%各8 min；90%和100%各6 min； 然后用乙酸異戊酯置換20 min，臨界點干燥。分別將三個部位進(jìn)行橫切， 取3 個重復(fù)； 并將部位1 與部位3 進(jìn)行縱切，取3 個重復(fù)。然后將樣品橫截面與縱切面用導(dǎo)電膠粘貼于樣品臺上， 用離子濺射儀將樣品表面鍍膜后，放入掃描電鏡腔室進(jìn)行觀察。

1.3.2 激光共聚焦拉曼成像分析導(dǎo)管結(jié)構(gòu)成分

將B 組樣品迅速轉(zhuǎn)入FAA 標(biāo)準(zhǔn)固定液（50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1）中固定，緩慢將葉片撕開，分離出導(dǎo)管。采用激光共聚焦拉曼成像系統(tǒng)進(jìn)行光譜采集和成像。 光譜采集時采用100 倍物鏡（ZEISS，NA=0.9）、50 倍物鏡（ZEISS，NA=0.8）以及785 nm 激發(fā)波長。 測試時光柵為300 mm-1，掃描步距200 nm，成像時單點光譜采集時間3 s，掃描范圍 200～1800 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 Nano Measurer 1.2 和 ImageJ 1.8.0 軟件對導(dǎo)管相對數(shù)量和導(dǎo)管內(nèi)徑進(jìn)行測量。 導(dǎo)管相對數(shù)量是在 X2500 （2000 μm2）下統(tǒng)計，隨機(jī)統(tǒng)計 10個視野，取平均值；導(dǎo)管內(nèi)徑是隨機(jī)測量10 個導(dǎo)管分子的長和寬，取平均值。 利用Excel 2010 軟件對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析， 用SPSS 17.0 軟件單因素方差分析中的Duncan 檢驗進(jìn)行顯著性分析 （p＜0.05）。 采用 Origin 2018 軟件作圖。 利用 WITec Project 5 軟件及自帶數(shù)據(jù)庫對激光共聚焦拉曼成像系統(tǒng)采集的拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行后期處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉中導(dǎo)管形態(tài)類型

茶葉導(dǎo)管在做青過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 圖2表明， 鮮葉中茶葉導(dǎo)管存在形式主要有螺紋導(dǎo)管（圖 2a）、網(wǎng)紋導(dǎo)管（圖 2b）和孔紋導(dǎo)管（圖 2c）3種。萎凋和前兩次做青階段孔紋導(dǎo)管較多，但在第三次搖青階段后螺紋導(dǎo)管增多， 出現(xiàn)網(wǎng)紋與孔紋結(jié)合的網(wǎng)孔紋導(dǎo)管（圖2d）且有導(dǎo)管壁消失的現(xiàn)象（圖 2e 和圖 2f）。

圖2 茶葉中導(dǎo)管存在類型Fig. 2 Types of vessels in tea

2.2 不同部位導(dǎo)管相對數(shù)量

茶樹地上部分的水分運輸途徑為莖木質(zhì)部導(dǎo)管→葉柄木質(zhì)部導(dǎo)管→葉脈木質(zhì)部導(dǎo)管→葉細(xì)胞間隙→葉肉細(xì)胞→氣孔→大氣， 質(zhì)外體途徑是茶樹水分主要運輸途徑[12]。 導(dǎo)管數(shù)量與導(dǎo)管運輸能力密切相關(guān)，葉片、葉柄以及莖這三個部位是水分運輸?shù)谋亟?jīng)之路， 其中葉柄的Ⅰ部分與葉片主脈相連， Ⅲ部分與莖相連， Ⅱ部分將Ⅰ與Ⅲ聯(lián)系起來。對以上五個部分的導(dǎo)管相對數(shù)量進(jìn)行比較，結(jié)果如表1 所示，導(dǎo)管相對數(shù)量大小順序為：葉片主脈＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞莖。

表1 不同部位導(dǎo)管相對數(shù)量Table 1 Relative number of vessels in different sites

圖3 鐵觀音在做青過程中葉片主脈導(dǎo)管內(nèi)徑及形態(tài)的變化Fig. 3 Changes of inner diameter and morphology of the vessels in leaves main vein of Tieguanyin during fine manipulation process

2.3 做青過程中葉片導(dǎo)管的變化特點

做青階段葉片主脈導(dǎo)管內(nèi)徑有顯著的變化（圖3）。 萎凋階段，葉片通過蒸騰作用失水，莖中水分向葉片主脈中遷移， 主脈中的水分向支脈木質(zhì)部導(dǎo)管遷移，葉片整體失水速率大，導(dǎo)致導(dǎo)管內(nèi)徑呈縮小趨勢。 搖青階段，由于外力作用，茶葉發(fā)生碰撞， 導(dǎo)管皺縮， 葉片主脈導(dǎo)管內(nèi)徑進(jìn)一步變小。晾青階段，茶葉因為搖青受到機(jī)械損傷后葉片呼吸作用加劇，細(xì)胞膨脹產(chǎn)生張力，水分由莖中木質(zhì)部導(dǎo)管向葉片主脈木質(zhì)部導(dǎo)管遷移， 導(dǎo)致晾青后導(dǎo)管內(nèi)徑變大。在前兩次做青中，導(dǎo)管內(nèi)徑都遵循搖青階段減小，晾青階段增大的趨勢，但在第三次晾青葉中，葉片含水量已顯著降低，導(dǎo)管內(nèi)徑不再增大，反而減小。

2.4 做青過程中莖部導(dǎo)管的變化特點

做青過程中莖內(nèi)導(dǎo)管內(nèi)徑發(fā)生了顯著變化（圖4a）。 萎凋階段，葉片蒸騰作用，莖內(nèi)水分向葉片運輸， 莖呈失水狀態(tài)， 莖部導(dǎo)管內(nèi)徑呈縮小趨勢。 第一次和第二次搖青階段，茶葉經(jīng)過碰撞，導(dǎo)管皺縮，莖部導(dǎo)管內(nèi)徑進(jìn)一步減?。▓D4d）。 第一次和第二次晾青階段， 在蒸騰拉力和毛細(xì)管力等作用下，莖內(nèi)水分、組織間的自由水以及一些生化反應(yīng)生成的內(nèi)含物質(zhì)通過導(dǎo)管壁上的開孔進(jìn)入導(dǎo)管[13-14]，莖部導(dǎo)管內(nèi)徑有增大趨勢。 第三次搖青葉與第二次晾青葉相比， 莖部導(dǎo)管內(nèi)徑?jīng)]有顯著變化。但在第三次晾青結(jié)束，莖部導(dǎo)管周圍的薄壁細(xì)胞皺縮，導(dǎo)管受到的壓力減小，且導(dǎo)管自身形態(tài)和結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化，出現(xiàn)網(wǎng)紋與孔紋結(jié)合的形式，導(dǎo)管壁消失， 導(dǎo)管排列松散， 莖部導(dǎo)管內(nèi)徑增大（圖 4e）。

圖4 鐵觀音在做青過程中莖部導(dǎo)管內(nèi)徑及形態(tài)的變化Fig. 4 Changes of inner diameter and morphology of vessels in stem of Tieguanyin during fine manipu lation process

2.5 做青過程中葉柄導(dǎo)管的變化特點

葉柄是連接莖與葉片的橋梁， 導(dǎo)管內(nèi)徑變化更復(fù)雜。 選擇葉柄的三個關(guān)鍵部分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ觀察發(fā)現(xiàn)不同部分導(dǎo)管內(nèi)徑大小有差異（圖5b）。 其中Ⅰ與Ⅲ導(dǎo)管內(nèi)徑大于Ⅱ， Ⅱ多為小導(dǎo)管或正在發(fā)育的導(dǎo)管，內(nèi)徑小，數(shù)量少。在做青過程中，Ⅰ和Ⅱ?qū)Ч軆?nèi)徑變化趨勢基本一致（圖5a），即在萎凋和搖青階段，導(dǎo)管內(nèi)徑呈減小趨勢，在晾青階段呈增大趨勢，與莖中導(dǎo)管內(nèi)徑變化趨勢相似。Ⅲ部分在做青過程中導(dǎo)管內(nèi)徑變化幅度較大， 與Ⅰ和Ⅱ在第一次搖青、 第三次搖青和第三次晾青階段變化趨勢不同。 第一次搖青葉的Ⅲ部分導(dǎo)管內(nèi)徑有增大的趨勢，與葉片和莖的變化趨勢都不同，原因有待研究； 第三次搖青葉和晾青葉的Ⅲ部分導(dǎo)管內(nèi)徑變化與葉片變化趨勢相同，導(dǎo)管內(nèi)徑變小。

圖5 鐵觀音品種在做青過程中葉柄導(dǎo)管內(nèi)徑及形態(tài)的變化Fig. 5 Changes of inner diameter and morphology of vessels in petiole of Tieguanyin during fine manipulation process

2.6 導(dǎo)管結(jié)構(gòu)成分變化

將鮮葉、 第三次晾青葉和炒青葉葉片主脈導(dǎo)管進(jìn)行分離（圖6a），通過拉曼光譜分析鮮葉導(dǎo)管結(jié)構(gòu)成分和做青、炒青過程對導(dǎo)管成分的影響（圖6c）。 拉曼光譜屬于分子特征光譜，譜帶頻率、強(qiáng)度和形狀與測試分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，且可以反映出相應(yīng)物質(zhì)含量變化。各樣品經(jīng)激光共聚焦拉曼顯微鏡掃描并與數(shù)據(jù)庫（ST-Japan）比對分析后發(fā)現(xiàn)：鮮葉導(dǎo)管中有三個是纖維素的特征峰[15-18]，分別是378 cm-1的吡喃環(huán)C-C-C 的對稱彎曲振動、1094 cm-1的糖苷鍵C-O-C 不對稱伸縮振動和1121 cm-1的糖苷鍵 C-O-C 對稱伸縮振動[19]。1279 cm-1是木質(zhì)素中芳香環(huán)扭曲振動和C=O 伸縮振動[20]。 1329 cm-1由 HCC 和 HCO 彎曲振動引起[20]，纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素對該峰都有貢獻(xiàn)。 1370 cm-1峰由 HCC、HCO 和 HOC 彎曲振動引起[20]，與纖維素和半纖維素有關(guān)。1458 cm-1與木聚糖中-OH 平面內(nèi)彎曲振動和亞甲基變形振動有關(guān)[21]。 1602 cm-1和1659 cm-1是木質(zhì)素的特征峰，1602 cm-1是苯環(huán)的對稱伸縮振動，1659 cm-1是松伯醇/芥子醇結(jié)構(gòu)的C=C 的伸縮振動[22]。 由以上分析結(jié)果推論，鮮葉中導(dǎo)管主要結(jié)構(gòu)成分為纖維素、 半纖維素和木質(zhì)素。 第三次晾青葉和炒青中導(dǎo)管結(jié)構(gòu)成分種類變化不顯著， 但是成分含量有變化。 做青后1279～1370 cm-1波段的峰，峰強(qiáng)明顯減弱，該成分含量降低；炒青后，纖維素特征峰1092 cm-1強(qiáng)度顯著降低。

圖6 葉片主脈導(dǎo)管在加工過程中拉曼光譜和共聚焦拉曼成像Fig. 6 Raman spectroscopy and confocal Raman imaging of the leaves main vein vessel during processing

為進(jìn)一步分析導(dǎo)管主要結(jié)構(gòu)成分纖維素（1094 cm-1）和木質(zhì)素（1602 cm-1）在鮮葉，做青和炒青后其分布狀態(tài)的變化， 用激光共聚焦拉曼成像技術(shù)對鮮葉、 第三次晾青葉和炒青葉中葉片主脈導(dǎo)管剖面掃描成像（圖6b）。 拉曼映射強(qiáng)度與樣品中所含有機(jī)成分的濃度成正相關(guān)。 由圖6d 可見， 導(dǎo)管縱切剖面靠近中心部分纖維素和木質(zhì)素含量高，越靠近導(dǎo)管表面，拉曼映射強(qiáng)度越低，纖維素和木質(zhì)素分布較少。茶葉經(jīng)過做青后，導(dǎo)管表面光斑分散，纖維素和木質(zhì)素分布分散，顯示導(dǎo)管結(jié)構(gòu)可能出現(xiàn)松散狀態(tài)， 這與掃描電鏡觀察到的網(wǎng)孔紋導(dǎo)管數(shù)量增加趨勢符合。 高溫炒青進(jìn)一步影響導(dǎo)管中纖維素的分布， 導(dǎo)管表面拉曼映射強(qiáng)度與鮮葉相比顯著降低。

3 討論

茶葉中導(dǎo)管類型主要是螺紋導(dǎo)管、 網(wǎng)紋導(dǎo)管和孔紋導(dǎo)管。茶葉導(dǎo)管主要結(jié)構(gòu)成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，這與其他植物導(dǎo)管成分相似。隨著茶葉加工的進(jìn)行導(dǎo)管形態(tài)和結(jié)構(gòu)成分會發(fā)生改變。 形態(tài)上， 導(dǎo)管在萎凋和搖青階段導(dǎo)管內(nèi)徑減小，晾青階段內(nèi)徑增大，但在第三次晾青結(jié)束，葉片含水率顯著降低，主脈導(dǎo)管內(nèi)經(jīng)沒有繼續(xù)增大。茶葉從第三次搖青階段后有網(wǎng)孔紋導(dǎo)管出現(xiàn)，而且有導(dǎo)管壁消失的現(xiàn)象。 產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是搖青過程中葉片的碰撞[23]、晾青過程中葉片的翻動等多種外力作用對導(dǎo)管產(chǎn)生的拉力和做青過程中的酶促氧化對導(dǎo)管成分產(chǎn)生的影響。 為證實這一猜測， 研究采用激光共聚焦拉曼成像技術(shù)直觀的觀察做青和炒青中導(dǎo)管成分的變化。 掃描結(jié)果顯示，在1270～1370 cm-1波段，峰強(qiáng)在做青后降低，有研究認(rèn)為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素對這一波段波峰強(qiáng)度都有貢獻(xiàn)[24]。 炒青后導(dǎo)管纖維素含量顯著降低， 這可能與做青過程的酶促反應(yīng)和高溫殺青的熱化學(xué)作用能使茶葉中部分大分子物質(zhì)降解形成小分子物質(zhì)[25]，部分纖維素降解成可溶性糖有關(guān)。

研究結(jié)果清楚展示了導(dǎo)管在做青過程中形態(tài)與結(jié)構(gòu)成分的變化規(guī)律， 也進(jìn)一步印證烏龍茶選擇莖壯葉肥的鮮葉原料， 木質(zhì)部導(dǎo)管形態(tài)會更利于走水。在萎凋和晾青階段，輕緩操作避免葉片損傷可以保持導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)， 利于實現(xiàn)水分和內(nèi)含物質(zhì)的遷移。同時隨著加工進(jìn)行，茶葉導(dǎo)管本身結(jié)構(gòu)成分發(fā)生了變化，其中部分纖維素含量降低，水解成小分子碳水化合物參與茶葉品質(zhì)的形成。