陳博雯， 肖玉菲， 李軍集， 張 燁， 覃子海， 張曉寧， 劉海龍

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國(guó)家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530002)

桉樹(Eucalyptus)是桃金娘科桉屬植物的總稱，原產(chǎn)地為澳大利亞[1-2]。目前，全世界有100多個(gè)國(guó)家種植桉樹，在我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)引種種植已有100多年的歷史[3-5]。由于桉樹速生豐產(chǎn)并且材質(zhì)優(yōu)良，已經(jīng)成為短周期原料林的主要造林樹種，被廣泛用于制漿造紙、人造板和纖維板等，特別是在造紙木漿生產(chǎn)中具有重要地位[6-8]。

在傳統(tǒng)選育優(yōu)良紙漿材品種的基礎(chǔ)上，利用基因工程手段改良木材品質(zhì)是國(guó)際上研究的熱點(diǎn)[9-10]。尾葉桉GLU4無(wú)性系(Eucalyptusurophyllaclone GLU4)是廣西廣泛種植的桉樹良種，以此樹種為基礎(chǔ)，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育低木質(zhì)素桉樹品種，具有良好的應(yīng)用前景。為此，廣西林科院已經(jīng)率先在尾葉桉良種GLU4的基礎(chǔ)上開展了木質(zhì)素調(diào)控的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，且經(jīng)過(guò)前期研究已取得一定進(jìn)展，在一系列木質(zhì)素合成途徑基因中，已鎖定應(yīng)用尾葉桉肉桂酰乙醇脫氫酶基因(EuCAD)轉(zhuǎn)化煙草可抑制木質(zhì)素合成[11-12]。在前述對(duì)EuCAD基因研究中使用的是基因全長(zhǎng)序列構(gòu)建RNA干擾載體，序列較長(zhǎng)，載體構(gòu)建和應(yīng)用均不便捷，而RNAi技術(shù)的優(yōu)勢(shì)之一，就是利用較短的干擾片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。為此，選擇模式植物煙草，采用生物信息學(xué)工具分析其EuCAD基因序列，根據(jù)編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分布情況分別選擇EuCAD基因的部分序列構(gòu)建RNA干擾抑制表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化植物，利用遺傳轉(zhuǎn)化體系檢測(cè)分析不同位置選取的干擾片段對(duì)煙草CAD基因表達(dá)及木質(zhì)素合成的調(diào)控效果，篩選鑒定出EuCAD中RNAi效果最佳的基因片段，以期為尾葉桉GLU4無(wú)性系肉桂酰乙醇脫氫酶基因(EuCAD)調(diào)控其木質(zhì)素的合成提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組培苗及菌株 煙草無(wú)菌組培苗、DH5α菌株和農(nóng)桿菌LBA4404菌株，由廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑盒 RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；RNA LA PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物工程有限公司；SG Fast qPCR Master Mix(2X)，購(gòu)自上海生工生物公司。

1.1.3 儀器 Nikon Eclipse80i光學(xué)顯微鏡，尼康公司；LightCycler480熒光定量PCR儀，羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 RNAi載體的構(gòu)建 利用Blastp、ProtParam、psipred、SWISS-MODEL等對(duì)EuCAD基因序列分析其編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，其分布在40～300氨基酸。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的分布情況，分別選擇包含NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和Zn結(jié)合催化位點(diǎn)的S1片段；包含多個(gè)Zn結(jié)合結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的S2片段；包含多個(gè)NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)的S3片段，以及帶有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和二聚體結(jié)合界面序列的S4片段用于構(gòu)建RNAi載體。每條選定片段利用Vector NTI分析篩選出40 bp左右片段，序列信息為S1-gaatttgccacagtgacattcaccagatcaagaatgatcttggcgc，S2-tggttgggtgccgcagaagctgtggcccttgcaattcggaccagctg，S3-atgtgcgctggtgtgaccgtgtacagtcctctggtgcgctttgg，S4-ccatggttatgcttgggaggaagtcaatcactgggagtttcata。利用序列設(shè)計(jì)成反向重復(fù)序列，在每條序列兩端附加X(jué)hoI酶切位點(diǎn)后，交由上海生工生物公司合成序列，得到攜帶目標(biāo)片段的克隆載體pUC57-S1、pUC57-S2、pUC57-S3和pUC57-S4。利用XhoI酶分別消化pUC57-S1、pUC57-S2、pUC57-S3和pUC57-S4，通過(guò)凝膠電泳回收得到目標(biāo)序列，同時(shí)利用XhoI酶消化pCAMBIA3301載體，同樣經(jīng)過(guò)凝膠電泳回收后，得到去除bar基因序列的載體骨架。分別將載體骨架與4條合成序列連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，應(yīng)用載體上的測(cè)序引物3301-F(5＇-CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3＇)/3301-R(5＇-CGCTGAAATCACCAGTCTCTC-3＇)對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)可擴(kuò)增得到目標(biāo)長(zhǎng)度片段的克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列比對(duì)，序列一致即為構(gòu)建成功的RNAi載體。RNAi載體構(gòu)建成功后，按常規(guī)方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中用于轉(zhuǎn)化。

1.2.2 煙草轉(zhuǎn)化植株的培育 利用RNAi載體轉(zhuǎn)化獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株，經(jīng)過(guò)愈傷組織培養(yǎng)和芽再生培養(yǎng)，經(jīng)抗生素篩選獲得陽(yáng)性植株，移栽后置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，同時(shí)保留每個(gè)植株的組培繼代芽，以備后續(xù)擴(kuò)繁培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株之用。移栽60 d后，取葉片提取基因組總DNA。應(yīng)用載體上的測(cè)序引物3301-F/3301-R，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)對(duì)長(zhǎng)度相符的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序以驗(yàn)證插入的RNAi序列準(zhǔn)確性。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株CAD基因的表達(dá)水平 4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株移栽培養(yǎng)240 d后，以野生型(WT)植株為對(duì)照，自莖尖向下第3節(jié)處取葉片，提取RNA用于CAD基因表達(dá)水平檢測(cè)。

采用煙草actin基因作為內(nèi)參基因，煙草CAD(X62343.1)基因?yàn)槟繕?biāo)檢測(cè)基因，利用Vector NTI設(shè)計(jì)引物序列如下：

actin-F:CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA；actin-R: AACCGCCACTGAGCACAATA；CAD-F: GTATGGCACCAGAACAAGCAG；CAD-R: CCAATGCCTCTTGTCTCTTCTTAT。

植物組織樣品采用試劑盒提取并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR檢測(cè)條件為95℃持續(xù)3 min，40次循環(huán)，95℃持續(xù)7 s，55℃持續(xù)10 s 和72℃持續(xù)15 s。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物重復(fù)及3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1) 木質(zhì)部厚度測(cè)定。取溫室培育270 d的4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙植株，以野生型(WT)植株為對(duì)照，自莖部頂端向下數(shù)，選取其莖部第4節(jié)和第6節(jié)莖部組織，按常規(guī)方法制成石蠟切片，并用番紅-固綠法染色[13]。制好的切片用Nikon光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，NIS-Elements拍照并測(cè)量莖部直徑。測(cè)量時(shí)每個(gè)樣品選取1張切片，在莖部截面的各個(gè)方向分別采集60個(gè)莖部直徑數(shù)據(jù)和木質(zhì)部厚度數(shù)據(jù)。

2) 木質(zhì)素及纖維素含量測(cè)定。取溫室培育270 d的4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙植株，以野生型(WT)植株為對(duì)照，選擇自頂端向下第3～10節(jié)莖部，去除葉片后65℃烘干24 h，粉碎后過(guò)40目篩，用于木質(zhì)素和纖維素含量檢測(cè)。

木質(zhì)素含量：參照GB/T20808-2006要求采用酸性洗滌方法測(cè)定。稱取1 g樣品，加入2%CTAB和2～3滴正辛醇后煮沸1 h。消煮液用玻璃砂漏斗抽濾后，將漏斗轉(zhuǎn)移至50 mL燒杯中，加入15℃的12.0 mol/L硫酸至半滿，將結(jié)塊打碎并攪拌呈糊狀，20℃保溫3 h，期間根據(jù)流出量不斷補(bǔ)充12.0 mol/L硫酸。消解后抽濾并用熱水洗滌至pH試紙檢測(cè)呈中性。取出漏斗和殘余物置于105℃烘箱中烘干至恒重。

木質(zhì)素含量=烘干后木素殘?jiān)|(zhì)量/絕干樣品質(zhì)量×100%

纖維素含量：采用硝酸法測(cè)定。稱取1 g樣品置于錐形瓶中，加入25 mL硝酸-乙醇(4∶1)混合液，裝上回流冷凝器，沸水浴1 h，期間隨時(shí)震蕩燒瓶。靜置至殘?jiān)练e后小心倒出上清液至恒重的玻璃濾器中，用真空泵吸干濾液并將流入濾器中的殘?jiān)苹劐F形瓶中。量取25 mL硝酸-乙醇混合液分?jǐn)?shù)次將濾器及錐形瓶口附著的殘?jiān)迫肫績(jī)?nèi)。再次裝上回流冷凝器，沸水浴1 h。3次重復(fù)后，將錐形瓶?jī)?nèi)容物全部移入濾器，用10 mL硝酸-乙醇混合液洗滌殘?jiān)?，再用熱水洗滌至洗液中性，最后用乙醇洗?次，吸干濾液，濾器置于105℃烘箱中烘干至恒重。

纖維素含量=烘干后纖維素殘?jiān)|(zhì)量/絕干樣品質(zhì)量×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi載體的構(gòu)建

從圖1看出，pCAMBIA3301載體上的測(cè)序引物3301-F/3301-R分別位于XhoI酶切位點(diǎn)旁側(cè)約50 bp處，XhoI酶切位點(diǎn)之間的bar基因序列分別被替換為S1～S4的目標(biāo)序列，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度從650 bp左右縮短至約200 bp。每個(gè)載體都檢測(cè)得到擴(kuò)增出目標(biāo)特異性條帶的陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，插入序列與預(yù)期序列一致，RNAi載體構(gòu)建成功，分別命名為pCAMBIA3301-S1、pCAMBIA3301-S2、pCAMBIA3301-S3和pCAMBIA3301-S4。

2.2 煙草轉(zhuǎn)化植株的培育

從圖2可見，RNAi載體轉(zhuǎn)化獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株基因組上插入RNAi載體的轉(zhuǎn)基因植株中可檢測(cè)到長(zhǎng)度200 bp的特異性片段，而未整合RNAi載體的植株則未擴(kuò)增到目標(biāo)條帶。陽(yáng)性植株經(jīng)進(jìn)一步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，其序列與目標(biāo)RNAi序列一致，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株分別命名為pS1、pS2、pS3和pS4。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株CAD基因的表達(dá)水平

從圖3看出，pS1、pS2、pS3和pS44個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株的CAD基因表達(dá)水平與野生型(WT)相比，均呈顯著下降趨勢(shì)，pS1與pS2間差異不顯著，pS1和pS2顯著低于pS3和pS4，pS3顯著低于pS4。其中，pS1和pS2降幅最大，分別為87.48%和87.30%；pS3降幅其次，為67.93%；pS4降幅最小，為49.70%。從基因表達(dá)調(diào)控效果看，RNAi片段S1和S2的調(diào)控效果最好。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株莖部直徑及木質(zhì)部的厚度

從表1可知，野生型和4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株莖部直徑及木質(zhì)部厚度的變化。直徑：第4節(jié)和第6節(jié)分別為6 194.57～6 634.29 μm和8 293.15～8 576.63 μm，依次分別為WT>pS2>pS4>pS1>pS3和WT>pS4>pS1>pS2>pS3，不同植株間差異均不顯著。木質(zhì)部厚度：第4節(jié)為283.21～320.91 μm，依次為WT>pS4>pS3>pS2>pS1，WT與pS3和pS4差異不顯著，但顯著厚于pS1和pS2；pS1、pS2、pS3和pS4間差異不顯著。第6節(jié)為384.53～427.53 μm，依次為WT>pS3>pS4>pS2>pS1，WT顯著厚于pS1，與其余3個(gè)植株間差異不顯著；pS1、pS2、pS3和pS4間差異不顯著。

表1 轉(zhuǎn)化植株莖部直徑及木質(zhì)部的厚度Table 1 Diameter and xylem thickness in the stem of transformed plants μm

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草植株莖部木質(zhì)素及纖維素的含量

從表2可知，野生型和4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素及纖維素含量的變化。木質(zhì)素：WT最高，為13.37%；pS4其次，為12.36%；pS1最低，為11.33%；WT顯著高于其余植株，pS1顯著低于其余植株，其余植株間差異顯著。pS1、pS2、pS3和pS4分別較WT降低15.26%、11.44%、10.62%和7.55%。纖維素：pS3最高，為36.08%；WT其次，為35.16%；pS1最低，為31.43%；pS3顯著高于其余植株，pS1顯著低于其余植株，其余植株間差異顯著。pS1、pS2和pS4較WT分別降低10.61%、5.03%和3.10%，pS3較WT提高2.62%。

表2 轉(zhuǎn)基因煙草植株的木質(zhì)素及纖維素含量Table 2 Lignin and cellulose content in transgenic tobacco %

3 結(jié)論與討論

由于調(diào)控靶序列的特異性和高效性，RNAi已成為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的首選方法[14]。在對(duì)目標(biāo)基因序列不清楚時(shí)，RNAi常采用基因全長(zhǎng)序列構(gòu)建RNAi載體，這種常規(guī)研究策略在許多植物中取得了較好的效果。但也有研究者指出，干擾片段過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使自身復(fù)制過(guò)程中堿基錯(cuò)配幾率增大，同時(shí)較長(zhǎng)的序列更容易與其他非目標(biāo)基因序列匹配，脫靶風(fēng)險(xiǎn)更高[15]。若選擇目標(biāo)基因的部分片段用于RNAi，所選擇的位置至關(guān)重要。HOLEN等[16]根據(jù)目標(biāo)基因的不同位置設(shè)計(jì)4條21～23 bp的RNAi片段研究發(fā)現(xiàn)一種可能的位置效應(yīng)，調(diào)控效果最佳的RNAi片段hTF167i和hTF372i能夠抑制85%～90%的基因活性，而 hTF562i片段只表現(xiàn)出一種中間效應(yīng)，hTF478i的活性則很低；且進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)靶點(diǎn)hTF167設(shè)計(jì)的干擾片段hTF158i和 hTF161i與hTF167i序列僅相差幾個(gè)堿基，幾乎完全喪失調(diào)控效果。張斌等[17]對(duì)OsPUT1基因的RNA干擾研究也提出類似的位置效應(yīng)，基因中段序列的干擾效果優(yōu)于首尾片段。由此推斷，針對(duì)目標(biāo)基因選擇RNA干擾片段時(shí)，既應(yīng)考慮片段在基因CDS中的位置，也應(yīng)考慮片段包含的特異性位點(diǎn)。

鑒于CAD蛋白在木質(zhì)素合成中的重要功能，在許多植物中都對(duì)其展開了研究，目前為止，NCBI已收錄2 428條陸生植物CAD蛋白序列，不同植物中的CAD具有高度的同源性。對(duì)CAD蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有CAD都具有三類典型的保守的結(jié)構(gòu)域。第一類是輔酶和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)。第二類是酶活性中心結(jié)構(gòu)域，包括Zn結(jié)合催化位點(diǎn)和Zn結(jié)合結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。第三類是二聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)CAD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白以二聚體形式存在，涉及到二聚體結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)域?qū)Χ垠w的形成與穩(wěn)定具有極其重要的作用[18]。

研究分別選擇包含NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和Zn結(jié)合催化位點(diǎn)的S1片段，包含多個(gè)Zn結(jié)合結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的S2片段，包含多個(gè)NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)的S3片段，以及帶有NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和二聚體結(jié)合界面序列的S4片段用于構(gòu)建RNAi載體。在將4條RNAi片段分別轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)，S3和S4片段的調(diào)控效果不理想，多項(xiàng)表型檢測(cè)結(jié)果與野生型相比降幅較小或無(wú)差異。S1和S2片段對(duì)木質(zhì)素的調(diào)控效果則最為明顯，從基因表達(dá)水平到木質(zhì)素含量和木質(zhì)部厚度均較野生型降低。

從序列編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域看，S1片段編碼蛋白兼具輔酶、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶催化結(jié)構(gòu)域，生物學(xué)功能重要；S2片段編碼蛋白則幾乎涵蓋CAD中所有預(yù)測(cè)的Zn結(jié)合結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，缺失前述任一段蛋白片段勢(shì)必極大地影響酶學(xué)活性。從基因序列位置分析，S1片段近于轉(zhuǎn)錄翻譯的起始端，S2片段也位于基因序列的前1/3處，若RNA干擾在S1或S2片段發(fā)生，CAD酶幾乎無(wú)法轉(zhuǎn)錄或翻譯，對(duì)酶活性的抑制將更明顯。前述分析結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明S1和S2片段是較為理想的RNAi片段。

S3和S4片段在設(shè)計(jì)時(shí)涵蓋了大多數(shù)的預(yù)測(cè)NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和二聚體結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)域，但S3和S4片段的調(diào)控效果卻甚微，可能是由于S3和S4片段引發(fā)RNA干擾時(shí)，由于片段位于基因中后部，大部分序列仍可翻譯為殘損的CAD蛋白，殘損蛋白雖缺失上述片段編碼的結(jié)構(gòu)域，但蛋白的其他NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)和二聚體結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)可能仍具有活性，所以殘損蛋白仍具有生物學(xué)活性。此外，研究中選取的片段長(zhǎng)度為44 bp，在后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化縮短干擾片段，有望獲得高效RNAi片段。

研究結(jié)果表明，植物莖部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是從上到下木質(zhì)化程度逐漸提高，而在pS1和pS2植株中，隨著木質(zhì)化程度的提高，通過(guò)抑制CAD基因表達(dá)調(diào)控木質(zhì)素合成的效果逐漸弱化。造成此變化的原因可能是CAD對(duì)木質(zhì)素合成的調(diào)控主要發(fā)生在木質(zhì)化初期，在木質(zhì)化中后期，其調(diào)控效果被其他代謝通路中的基因應(yīng)答作用所掩蓋。同時(shí)，pS1和pS2植株中木質(zhì)部厚度的降幅均在10%左右，降幅較低，較小的降幅可能在木質(zhì)化過(guò)程中被逐漸積累的木質(zhì)部厚度稀釋，造成降幅差異逐漸減小。對(duì)此，在后續(xù)研究中，可嘗試使用底物標(biāo)記等手段，分階段解讀木質(zhì)化過(guò)程，有望深入揭示抑制CAD基因調(diào)控木質(zhì)素合成的生理生化機(jī)制。