楊雨晴，李洋洋，程 旭，韓慧明，李詠梅，朱滕滕

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院虹橋國際醫(yī)學(xué)研究院，上海 200336)

肺癌已成為我國發(fā)病率和死亡率居于首位的癌癥[1]，雖然肺癌的治療手段與技術(shù)不斷提升，但其5 a內(nèi)生存率依然不足15%[2]，吸煙和環(huán)境污染以及遺傳因素為非小細(xì)胞肺癌發(fā)病的主要因素[3].肺癌按照組織病理分型可大致分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌.非小細(xì)胞肺癌可粗分為3大類：肺腺癌、鱗狀上皮癌和大細(xì)胞癌[4].肺癌的治療方法主要有外科治療、化學(xué)療法和靶向治療，但肺癌患者預(yù)后較差，因此，探索肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找更安全、更有效的基因治療靶點(diǎn)，能夠?yàn)榉伟┗颊吲R床治療提供新的思路.

在基因轉(zhuǎn)錄過程中存在大量不具有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA，盡管絕大多數(shù)被稱為轉(zhuǎn)錄“噪音”的非編碼RNA未表現(xiàn)出其具體的分子機(jī)制和生物學(xué)功能，但已有部分RNA在不同細(xì)胞類型中出現(xiàn)特異性表達(dá)，并定位于亞細(xì)胞區(qū)室，作為細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子參與人類疾病的進(jìn)程[5].長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指大于200 bp的不具有編碼能力的核苷酸序列.目前的研究[6]表明：lncRNA可以通過多重方式對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，與染色質(zhì)修飾的復(fù)合物結(jié)合，調(diào)控基因在表觀遺傳學(xué)上的轉(zhuǎn)錄活性；lncRNA可以與microRNA結(jié)合形成海綿體，調(diào)控基因翻譯后的修飾與加工[7]；與轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合，在其活性及基因組定位中發(fā)揮作用[8-9].近年來，lncRNA作為基因表達(dá)調(diào)控的新層面，除了參與正常的生理過程外，lncRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有不可替代的作用，其異常表達(dá)可作為癌癥早期診斷及患者治療后進(jìn)展情況的生物學(xué)標(biāo)志物[10].有研究[11-14]顯示：lncRNA HOTAIR通過重新編程染色質(zhì)狀態(tài)進(jìn)而促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移；LincRNA00673作為一種潛在的腫瘤抑制因子，其種系變異與胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；lncRNA LCPAT1與香煙提取物協(xié)同作用可誘導(dǎo)DNA損傷[13]，敲減lncRNA LCPAT1可以抑制肺癌中的自噬現(xiàn)象[14].

lncRNA HAGLROS是長度為699 bp的長鏈非編碼RNA，位于染色體2q31.1上.已有研究[15]表明：lncRNA HAGLROS通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中miR-5095/ATG12軸，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)自噬；lncRNA HAGLROS的下調(diào)可能通過海綿狀miR-100/ATG5軸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬[16].lncRNA HAGLROS在肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌[17]等發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)程的作用，但其在非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)生機(jī)制目前還不明確.本文旨在研究lncRNA HAGLROS在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并初步探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲進(jìn)程的影響，為臨床治療提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑及siRNA設(shè)計(jì)

高糖基本培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰酶(Gibco公司，美國)；RNA抽提試劑TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell小室(BD公司，美國)；結(jié)晶紫染液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；lncRNA-HAGLROS引物設(shè)計(jì)后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；lncRNA-HAGLROS干擾RNA(siRNA lncRNA-HAGLROS)、陽性對(duì)照GAPDH以及陰性對(duì)照Negative Control設(shè)計(jì)后委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成.

1.2 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的培養(yǎng)

應(yīng)用含10%胎牛血清和加入1%青霉素-鏈霉素抗菌藥物的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549，所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2條件細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，每1～2 d觀察狀態(tài)，傳代換液.待細(xì)胞傳了三代穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞接種于6孔板中待后續(xù)研究.

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將A549細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，每孔加入4 μL lipofectamine2000和100 pmol siRNA lncRNA HAGLROS混合液.同時(shí)設(shè)置3組實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對(duì)照組(Blank)、陰性對(duì)照組(Negative control，NC)、陽性對(duì)照組(GAPDH)；在NC與GAPDH實(shí)驗(yàn)組中加入等量的試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后換液.

siRNA lncRNA HAGLROS序列：HAGLROS-homo-435：5′CCCGAGUGUCACCCU UAAATTUUUA AGGGUGACACUCGGGTT3′；HAGLROS-homo-621：

5′GCUAAACUUGAAUGCCAUUTTAAUGGCAUUCA

AGUUUAGCTT3′；HAGLROS-homo-97：5′CCUACUU

CAGCAAGUCUTTAGACUUGCUCUGAAGUAGGTT3′；

Negative Control：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTTA

CGUGACACGUUCGGAGAATT3′.

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LncRNA HAGLROS的表達(dá)差異

當(dāng)接種的細(xì)胞總量生長達(dá)到80%時(shí)，使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以Actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT方法檢測(cè)lncRNA HAGLROS的表達(dá)差異.

lncRNA HAGLROS上游引物5′-TGTCACCCTT AAATACCGCTCT-3′；下游引物5′-CTTCCTCCCAC ACAAATACTCC-3′.Actin的上游引物5′-CATGTAC GTTGCTATCCAGGC-3′；下游引物5′-CTCCTTAATG TCACGCACGAT-3′.GAPDH的上游引物5′-CGGAG TCAACGGATTTGGTC-3′；下游引物5′-CGGTCCAT GGAATTTGCC A-3′.

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞使用黃槍頭對(duì)齊6孔板盒縱向垂直劃線，縱向劃線1條，在6孔板后面橫向劃線3條，進(jìn)行分區(qū).用PBS清洗細(xì)胞，除去漂浮的細(xì)胞，換液后使用含2%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞孵育.在0、48 h時(shí)拍照，計(jì)算愈合效率后檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力.愈合效率計(jì)算如下：

愈合效率=(0 h細(xì)胞劃痕面積-48 h細(xì)胞劃痕面積)/0 h細(xì)胞劃痕面積.

其中，細(xì)胞劃痕面積使用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量.

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞離心后棄液，懸浮于無血清培養(yǎng)基中，10倍稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù).將稀釋成品基質(zhì)膠稀釋液置于冰盒上，每個(gè)小室垂直加入60 μL融化的基質(zhì)膠稀釋液，過程中不能出現(xiàn)氣泡.隨后，將24孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min以上，使基質(zhì)膠熱凝后取出24孔板，加入200 μL基本培養(yǎng)基到每個(gè)小室內(nèi)進(jìn)行水化.將24孔板再次放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育熱凝30～50 min，吸去用于水化的培養(yǎng)基，此過程中不要戳到基質(zhì)膠，可以殘留部分液體.在每個(gè)小室內(nèi)種植40 000個(gè)細(xì)胞，使用基本培養(yǎng)基制備成300 μL的細(xì)胞懸液加入到小室中，然后在各個(gè)小室底層分別加入700 μL完全培養(yǎng)基.為避免細(xì)胞遷移過程中有氣泡產(chǎn)生，將24孔板于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，吸掉小室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS清洗3次；每個(gè)小室外加入750 μL 4%PFA，室溫固定細(xì)胞15 min，PBS清洗細(xì)胞3次；每個(gè)小室外加650 μL 0.1%結(jié)晶紫，室溫染色細(xì)胞15 min，PBS清洗細(xì)胞3次.24孔板干燥后，使用倒置熒光顯微鏡(OlympusIX73)隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并比較各組細(xì)胞侵襲能力.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 siRNA的敲減水平

3條siRNA轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株中，設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)組3組與空白對(duì)照組，3組實(shí)驗(yàn)組分別代表siRNA的3條鏈，利用qPCR檢測(cè)siRNA-lncRNA HAGLROS在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平.qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：3條siRNA均有明顯的敲減作用，其中siRNA-LncRNA HAGLROS-homo-435敲減效果最好，敲減效率約為65%，3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).見圖1.

2.2 下調(diào)lncRNA HAGLROS的表達(dá)可以抑制A549細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染siRNA lncRNA HAGLROS-homo-435的A549細(xì)胞48 h后，陰性對(duì)照(NC)組48 h愈合率為58%，si435實(shí)驗(yàn)組48 h愈合率為47%，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組48 h愈合率為64%，si435實(shí)驗(yàn)組48 h愈合率為47%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明抑制A549細(xì)胞中LncRNA HAGLROS的表達(dá)可以降低A549細(xì)胞的遷移能力.見圖2.

2.3 下調(diào)lncRNA HAGLROS的表達(dá)可以抑制A549細(xì)胞的侵襲能力

分析Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：si435實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量比NC組少25%，比Blank組少30%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說明下調(diào)lncRNA HAGLROS基因的表達(dá)后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力減弱.見圖3.

3 討 論

腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的相關(guān)信號(hào)通路主要有控制細(xì)胞黏附和控制細(xì)胞骨架兩大類，細(xì)胞的遷移與侵襲主要與細(xì)胞骨架和黏附相關(guān).細(xì)胞遷移是細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生移動(dòng)，細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一，是機(jī)體正常生長發(fā)育的生理過程[18]，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式.腫瘤細(xì)胞在體外仍具有遷移能力，其遷移能力的強(qiáng)弱是癌癥惡性程度的指標(biāo)之一.細(xì)胞劃痕法是測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的有效方法，通過體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停隗w外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上劃痕致傷，然后比較不同實(shí)驗(yàn)組中腫瘤細(xì)胞遷移的能力[19].腫瘤細(xì)胞由其原發(fā)部位侵入血管或淋巴管或體腔，部分細(xì)胞被血流、淋巴流帶到其他部位或器官，并在該處繁殖生長，形成與原發(fā)瘤同樣類型的腫瘤，這一過程即為轉(zhuǎn)移.侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前奏，轉(zhuǎn)移是侵襲的繼續(xù)和結(jié)果[20].Transwell實(shí)驗(yàn)為腫瘤細(xì)胞侵襲模型，其原理是通過一層聚碳酸酯膜，利用不同營養(yǎng)程度的培養(yǎng)液將上下兩室細(xì)胞區(qū)分開來，進(jìn)而研究細(xì)胞的侵襲能力[21].癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力是反應(yīng)癌癥惡性程度的重要指標(biāo)，也是癌細(xì)胞功能研究的主要手段，本研究以侵襲和遷移為主要指標(biāo)驗(yàn)證lncRNA HAGLROS在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)分別可以驗(yàn)證細(xì)胞的遷移能力與侵襲能力，通過研究癌細(xì)胞的生物學(xué)功能可為臨床診治及患者預(yù)后提供依據(jù).

本研究前期通過對(duì)肺癌組織與癌旁組織表達(dá)芯片以及TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌相關(guān)信息進(jìn)行了分子生物信息學(xué)分析，選定了lncRNA HAGLROS為主要研究對(duì)象，并首先通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了lncRNA HAGLROS在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中高表達(dá)；其次利用上海吉瑪制藥有限技術(shù)公司合成的HAGLROS-siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染siRNA，以敲低IncRNA HAGLROS在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并探討其具體機(jī)制；最后確定有效的轉(zhuǎn)染效率及敲減效率后，進(jìn)一步通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下調(diào)lncRNA HAGLROS后對(duì)肺癌A549細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響.結(jié)果顯示：敲低lncRNA HAGLROS后能夠顯著抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移水平，提示lncRNA HAGLROS是一條促癌長鏈非編碼RNA.同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明：lncRNA HAGLROS在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)lncRNA HAGLROS可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，此結(jié)果可為肺癌的精準(zhǔn)靶向治療提供潛在的分子靶點(diǎn).本研究探討了lncRNA HAGLROS在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，但其亞細(xì)胞定位分析及具體作用的相關(guān)分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討.