林芳

摘 要：建立超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時(shí)測定面粉中曲酸和噻二唑的方法。色譜柱為ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），流動(dòng)相為0.1%甲酸5 mmol·L-1甲酸銨水溶液∶乙腈，梯度洗脫，流速為0.45 mL·min-1。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM），曲酸為ESI正電離源，定量離子對140.3/69;噻二唑?yàn)镋SI負(fù)電離源，定量離子對130.8/57.9。樣品經(jīng)純水超聲提取30 min，過膜后直接測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，曲酸在1.00～50.00 ?g·L-1，噻二唑在10.00～500.00 ?g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)≥0.995。面粉樣品中3個(gè)濃度加標(biāo)水平即曲酸含量0.10、0.20和0.40 mg·kg-1，回收率為100.00%～105.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.50%～10.72%;噻二唑含量1.00、2.00和4.00 mg·kg-1，回收率為86.00%～89.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.65%～9.97%。該方法操作簡便、回收率高，可用于大批量面粉中曲酸和噻二唑的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞：面粉;曲酸;噻二唑;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

Abstract：A new method was developed for the determination of Kojic acid （KA） and 2-mercapto-5-methyl-1，3，4-thiadiazde （MMTD） in flour by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry/mass spectrometry. The chromatography column was ACQUITY UPLC? BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 ?m）， mobile phases were 0.1%formic with 5 mmol·L-1 ammonium formate in water solution and acetonitrile， with gradient elution， the flow rate was 0.45 mL·min-1. Using multiple reaction monitoring （MRM） mode， the ESI mass spectrometry was positive ion source for KA， 143.1/69 and negative ion source for MMTD， 130.8/57.9. The sample was extracted by water solution， the quantitation was carried out with the external standard method. The linear range of the method was 1.00～50.00 ?g·L-1 for KA and 10.00～500.00 ?g·L-1

for MMTD， with a correlation coefficient not less than 0.995. The recoveries in flour matrix at the three spiked levels of 0.10， 0.20， 0.40 mg·kg-1 for KA and 1.00， 2.00，4.00 mg·kg-1 for MMTD， were in the range of 100.00%～105.00% for KA and 86.00%～89.00% for MMTD， and the relative standard deviations were in the range of 2.50%～10.72% for KA and 3.65%～9.97% for MMTD. The method is simple， high recoveries and is suitable for the simultaneous confirmation and quantificaition of KA and MMTD residue in flour which applies in batch detection.

Key words：Flour; Kojic acid; 2-mercapto-5-methyl-1，3，4-thiadiazde （MMTD）; UPLC-MS/MS

中圖分類號：TS207.3

曲酸（Kojic acid，KA），化學(xué)名為5-羥基-2-羥甲基-1，4-吡喃酮，易溶于水、乙醇和丙酮，1907年由齋藤從蒸米發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)[1]。曲酸具有多種生物活性，如抑制酪氨酸酶活性[2-3]，廣泛在化妝品和藥物制劑中使用[4]，減少黑素的形成。聶西度等[5]表示曲酸分子中的羥基可以使人體內(nèi)積累游離基有致癌性。陳永紅等[6]以小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)體外試驗(yàn)在一定時(shí)間內(nèi)高質(zhì)量濃度曲酸可以導(dǎo)致DNA損傷。因此曲酸的安全性已成為人們關(guān)注和爭論的焦點(diǎn)。噻二唑（2-Mercapto-5-methyl-1，3，4-thiadiazde，MMTD），學(xué)名2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑，溶于熱水、甲醇、乙醇，是生產(chǎn)頭孢菌素類等醫(yī)藥的重要中間體，具有抗菌性。有研究發(fā)現(xiàn)，MMTD對斑馬魚的胚胎具有一定的毒性[7]。

2017年第132號[8]指出嚴(yán)禁生產(chǎn)企業(yè)在小麥粉中添加噻二唑、曲酸等非食品原料。目前國內(nèi)外檢測方法集中在對曲酸的檢測分析，如有電化學(xué)分析法[9]、近紅外光譜法[10]、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液質(zhì)聯(lián)用測試[13]。關(guān)于食品中曲酸和噻二唑同時(shí)檢測的報(bào)道較少，本文建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)測定面粉中曲酸和噻二唑，為安全監(jiān)管提供可行性的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No. 501-30-4，純度99.9%），Be

Pure公司;噻二唑（CAS No. 29490-19-5，純度100%），

BePure公司;甲酸（HPLC級，純度99.0%），美國DiKMA公司;乙腈（HPLC級，純度99.9%），美國DiKMA公司;甲酸銨（AR級），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水均為一級水，符合GB/T 6682-2008要求。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class系列超高效液相-串聯(lián)Waters XEVO TQ-S micro型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）及MassLynx V4.2 SCN 1001數(shù)據(jù)處理軟件），美國Waters公司;SF-TGL-16M型高速離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司;XW-80A

型漩渦器，上海青浦滬西儀器廠;950DAE超聲儀，美國ETL TESTING公司;JA2003A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司;Milli-Q型超純水儀，密里博中國有限公司;0.45 ?m針式聚四氟乙烯濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;100 ?L、1000 ?L移液槍，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC? BEH C18

（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），柱溫：45 °C，流速：

0.45 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 ?L，梯度洗脫，程序見表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流速：1 000 L/H，毛細(xì)管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150 ℃，孔電壓15 V，駐留時(shí)間：0.075 s。采用正負(fù)模式切換的電噴霧離子源，曲酸電噴霧為正離子模式（ESI+），定量離子對143.1/69，碰撞能為15 v;定性離子對143.1/97.1，碰撞能15 v。噻二唑電噴霧為負(fù)離子模式（ESI-），定量離子對130.8/57.9，碰撞能15 v;定性離子對130.8/89.8，碰撞能5 v。

1.3.3 前處理方法

稱取混勻后的樣品1.00 g，加入40 mL純水，超聲提取30 min，離心后，取上清液過0.45 ?m濾膜，注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

一般正離子模式適合于堿性樣品，負(fù)離子模式適合于酸性樣品。分別配制濃度為1.00 mg·L-1的曲酸和噻二唑單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液在不接色譜柱的條件下，使用電噴霧正離子模式（ESI+）進(jìn)行曲酸母離子全掃描和電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）進(jìn)行噻二唑母離子全掃描。確定曲酸的母離子m/z 143.1和噻二唑的母離子m/z 130.8，利用手動(dòng)優(yōu)化模式對它們的子離子、孔電壓和碰撞能等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確認(rèn)優(yōu)化后的參數(shù)，根據(jù)優(yōu)化后的最佳質(zhì)譜條件建立曲酸的ESI（+）和噻二唑ESI（-）的多反應(yīng)監(jiān)測方法。

2.2 色譜柱的選擇

比較了Waters CORTECS? HILIC和Waters ACQUITY

UPLC? BEH C18兩種柱子。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，200 ng的噻二唑在采用Waters CORTECS? HILIC柱上響應(yīng)值高，但對曲酸的保留性能很差，而選擇Waters ACQUITY UPLC? BEH C18 作為分離柱，曲酸（圖1中1）和噻二唑（圖1中2）可以同時(shí)在色譜柱上有保留（圖1所示），能完全分開。

2.3 前處理提取液的選擇

根據(jù)曲酸和噻二唑都易溶于水的性質(zhì)，考察了水、乙腈和50%乙腈水作為提取溶劑的提取效率。在陰性樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加，曲酸的添加量為0.1 mg·kg-1，噻二唑的添加量為1.0 mg·kg-1。實(shí)驗(yàn)表明，含有乙腈的提取溶劑，對噻二唑的提取效率沒有影響，但在曲酸出鋒位置有個(gè)干擾峰，沒法分開，影響了曲酸的定性及定量，而水作為提取溶劑時(shí)，干擾峰（圖2中的1）可以與目標(biāo)峰（圖2中的2）分開，如圖2所示，同時(shí)也滿足了提取的回收率要求，所以選擇水作為提取溶劑。

2.4 線性范圍和方法的檢出限、定量限

將配有曲酸1.00、2.50、5.00、10.00、25.00 ?g·L-1和50.00 ?g·L-1，噻二唑10.00、25.00、50.00、100.00、250.00 ?g·L-1和500.00 ?g·L-1的混合系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測試，分別以峰面積對曲酸和噻二唑的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考GB/T 27417-2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中空白偏差法評估方法檢出限和定量限。具體操作如下：分別在10個(gè)空白樣品中加入曲酸和噻二唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含有曲酸2.50 ?g·L-1和噻二唑25.00 ?g·L-1的樣品溶液，分別注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測試，得曲酸和噻二唑含量，分別計(jì)算曲酸和噻二唑含量的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差即為方法檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差即為方法定量限。結(jié)果表明，曲酸在1.00～50.00 ?g·L-1，噻二唑在10.00～500.00 ?g·L-1時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r大于0.995，方法的檢出限和定量限如表2所示。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

對陰性面粉樣品進(jìn)行曲酸和噻二唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，曲酸的加標(biāo)水平分別為0.10、0.20和0.40 mg·kg-1，噻二唑分別為1.00、2.00和

4.00 mg·kg-1，采用1.3.3的前處理方法對樣品進(jìn)行處理，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次，計(jì)算曲酸和噻二唑在面粉樣品中的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，曲酸的回收率為100.00%～105.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.50%～10.72%，噻二唑的回收率為86.00%～89.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.65%～9.97%，方法的加標(biāo)回收和精密度滿足質(zhì)量分析的要求