齊敏杰， 梁 娥 ， 張 來

(1. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550000; 2. 安順學(xué)院 功能材料與資源化學(xué)貴州省高校特色重點實驗室， 安順 561000； 3.中國科學(xué)院 昆明植物所， 昆明 650201)

次生代謝產(chǎn)物是藥用植物的主要藥用成分，目前通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[1]、愈傷組織培養(yǎng)[2]、根細(xì)胞培養(yǎng)[3]來調(diào)控藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累已有相關(guān)報道。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的有效途徑[4]；毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA片段被整合到寄主植物細(xì)胞的核基因組中而產(chǎn)生的[5]。筆者所在團(tuán)隊研究并總結(jié)了藥用植物毛狀根的培養(yǎng)與應(yīng)用，掌握了毛狀根具有生長速度快、激素自養(yǎng)和遺傳性狀相對穩(wěn)定等優(yōu)點[6]，并對藥用植物竹節(jié)參進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，成功培養(yǎng)了竹節(jié)參毛狀根單克隆體系，為極稀少的竹節(jié)參生產(chǎn)皂苷開辟了一條不依賴原植物體的全新有效途徑[7]；同時對竹節(jié)參正常根及毛狀根中精油成分進(jìn)行了比較分析[8]。誘導(dǎo)子(Elicitor)能快速專一地誘導(dǎo)植物體內(nèi)關(guān)鍵酶基因表達(dá)從而導(dǎo)致特定次生代謝產(chǎn)物的積累，這對研究和利用藥用植物特定藥用成分提供了新的思路和策略。

1 誘導(dǎo)子

當(dāng)受到某種因子刺激時，植物細(xì)胞易合成具有抵抗這種因子活性的次生代謝產(chǎn)物，這種因子就是誘導(dǎo)子。

1.1 誘導(dǎo)子的分類

根據(jù)來源的不同，誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是來源于微生物或動植物細(xì)胞中的物質(zhì)，主要是真菌孢子、細(xì)胞壁碎片和真菌絲等；非生物誘導(dǎo)子不是植物細(xì)胞中的天然成分，卻可以使植物產(chǎn)生防御化合物，主要有化學(xué)誘導(dǎo)子和物理誘導(dǎo)子兩類。常用的化學(xué)誘導(dǎo)子有植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulators)、水楊酸(Salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MJ)等；紫外線輻射、高低溫和溶氧量為物理誘導(dǎo)子。

1.2 誘導(dǎo)子的作用機(jī)理

關(guān)于誘導(dǎo)子的作用機(jī)理研究較少，目前大家普遍接受的是：誘導(dǎo)子作為外源信號被細(xì)胞膜上受體識別并結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性和流動性(Ca2+、H+內(nèi)流和 Cl-、K+外流)；然后細(xì)胞內(nèi)的第二信使(G蛋白、磷酸肌醇、cAMP等)把信號傳遞至細(xì)胞核；最終激活特異性基因，從而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物合成(圖1)[9]。誘導(dǎo)子通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累，因此找到誘導(dǎo)子對植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的合成積累影響過程中的影響因子具有重要意義。如經(jīng)過誘導(dǎo)子處理的煙草葉片中苯丙氨酸解氨酶活性增強(qiáng)，使多酚積累量增加[10]。經(jīng)過flg22誘導(dǎo)處理的擬南芥幼苗，在吲哚族芥子油苷核心結(jié)構(gòu)形成過程中CYP83B1和CYP79B2的表達(dá)水平顯著提高，芥子油苷積累量增加[11]。MJ的加入使菘藍(lán)毛狀根中CHI和F3′H基因的表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)其黃酮類次生代謝產(chǎn)物積累[12]。劉佳和吳能表[13]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同濃度的AgNO3均能提高pmt、trI和h6h基因的表達(dá)，從而增加托品烷類生物堿的積累量。

圖1 藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)模型[9]

2 不同類型的誘導(dǎo)子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

利用誘導(dǎo)子來促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累已成為毛狀根次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)過程中的主要方法之一，目前已經(jīng)在人參、顛茄、紫草和丹參等多種藥用植物中有相關(guān)報道。在研究誘導(dǎo)子對植物代謝影響的過程中，濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)調(diào)控的研究成為人們關(guān)注的焦點。濃度效應(yīng)是指不同濃度的誘導(dǎo)子其作用效果存在差異，特定的濃度能使次生代謝產(chǎn)物的積累量達(dá)到最高值；時間效應(yīng)是指在植物適應(yīng)自身生長環(huán)境之后加入誘導(dǎo)子使得次生代謝產(chǎn)物積累量最大化，不同植物對時間效應(yīng)的反應(yīng)速度存在差異，而不同植物的適應(yīng)能力也有所差異，因此需要逐步試驗和摸索。根據(jù)筆者所掌握的文獻(xiàn)資料對誘導(dǎo)子在藥用植物毛狀根中生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的研究和利用進(jìn)行歸納和整理。

2.1 生物誘導(dǎo)子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

近年來，在毛狀根培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入生物誘導(dǎo)子來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物積累的研究應(yīng)用較廣。酵母提取物(YE)是常用的生物誘導(dǎo)子之一。劉佳等[14]使用YE誘導(dǎo)顛茄毛狀根生長，發(fā)現(xiàn)一定濃度的YE既能增加顛茄毛狀根的積累又能提高托品烷類生物堿含量。以濃度為100 mg/L 的YE 作用于顛茄毛狀根培養(yǎng)至16 d，莨菪堿和東莨菪堿的產(chǎn)量分別是對照組的3.09 倍和 1.85 倍[15]；以濃度為50 mg/L的YE處理的西洋參毛狀根中人參總皂苷含量是對照組的1.57倍[16]。有學(xué)者研究指出霉菌也是較為常用的生物誘導(dǎo)子之一。如在黑曲霉和米曲霉?jié)舛容^低時均能促進(jìn)新疆紫草毛狀根中萘醌的積累[17]；以濃度為 40 mg/L的黑曲霉和20 mg/L的米曲霉處理黃芩毛狀根，使黃芩苷積累量增加了1.54%和1.17%[18]；閻巖[19]以4%的密旋鏈霉菌Act12的發(fā)酵液和菌絲體混合液處理丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)總丹參酮積累量最高為對照組的12.6倍。細(xì)菌作為誘導(dǎo)子的研究相對較少，僅見零星報道。尤紅[20]研究發(fā)現(xiàn)野生丹參內(nèi)生細(xì)菌是誘導(dǎo)其毛狀根中丹酚酸積累效果最好的菌株；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)用0.2%的蠟樣芽孢桿菌處理丹參毛狀根時，總丹參酮積累量是對照組的13倍[21]。

2.2 化學(xué)誘導(dǎo)子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

在藥用植物毛狀根培養(yǎng)體系中，諸多研究者常用植物生長調(diào)節(jié)劑、酯類、酚類和金屬鹽等化學(xué)誘導(dǎo)子來促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累。雖然毛狀根具有激素自養(yǎng)的優(yōu)點，但研究發(fā)現(xiàn)，植物生長調(diào)節(jié)劑能促進(jìn)毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累。如在添加1 mg/L NAA和 1 mg/L BA的情況下，酸漿果毛狀根的澳洲茄胺甙含量是不加激素的 2.6 倍多[22]。李春玲[23]研究發(fā)現(xiàn)加入0.5 mg/L NAA培養(yǎng)時，水飛薊毛狀根中水飛薊賓積累量是對照的1.6倍。MJ可以提高某些特定次生代謝產(chǎn)物含量。熊丙全等[24]在丹參毛狀根的培養(yǎng)液中加入MJ，發(fā)現(xiàn)MJ能顯著提高丹參毛狀根中丹參酮的積累。添加MJ能增加甜葉菊毛狀根中綠原酸類物質(zhì)含量，而添加SA則不能[25]。王瑜[26]研究指出，在王不留行毛狀根培養(yǎng)18 d時，分別加入150 μmol/L MJ和20 mg/mL SA繼續(xù)培養(yǎng)，則黃酮苷的積累量最高可達(dá)到對照組的5.32和3.78倍。低濃度的SA能明顯促進(jìn)水飛薊毛狀根中水飛薊賓積累[23]。

多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，金屬鹽作為誘導(dǎo)子對藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累也有促進(jìn)作用。如當(dāng)誘導(dǎo)子AgNO3濃度5 mg/L時，新疆紫草毛狀根中的紫草素、總多酚以及總黃酮的含量都比對照組高[27]；AgNO3的加入雖然抑制了顛茄毛狀根的生長，卻增加托品烷類生物堿的積累量[13]；在丹參毛狀根培養(yǎng)中也有類似現(xiàn)象，即 Ag+在增加丹參毛狀根中迷迭酸、咖啡和阿魏酸的積累量的同時抑制了丹參毛狀根的生長[28]。有研究指出，在天仙子毛狀根培養(yǎng)液中加入50 μmol/L硝普鈉后培養(yǎng)48 h時，發(fā)現(xiàn)毛狀根中東莨菪堿積累量達(dá)到最高值并且在對照的基礎(chǔ)上增加了1.2倍[29]；加入100 μmol/L硝普鈉后培養(yǎng)24 h時，則毛狀根中天仙子堿積累量達(dá)到最高值并且在對照的基礎(chǔ)上增加了1.5倍。

2.3 物理誘導(dǎo)子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝中的應(yīng)用

溫度、光照、溶氧量等物理誘導(dǎo)子對藥用植物毛狀根次生代謝也有一定調(diào)控和影響作用，在三分三、高麗參、雪蓮、黃芪、苦蕎、青蒿等植物毛狀根培養(yǎng)中已有報道。

毛狀根一般的生長溫度是20 ℃～25 ℃，但是不同的藥用植物毛狀根產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的最適溫度是不同的。如三分三在25 ℃培養(yǎng)條件下毛狀根中莨菪堿含量最高，是35 ℃的2.70倍[30]；高麗參毛狀根生物量以及人參皂苷產(chǎn)量在20 ℃/ 13 ℃[日(12 h) / 夜(8 h)]循環(huán)下達(dá)到最大值[31]；水母雪蓮毛狀根在24 ℃的培養(yǎng)條件下，毛狀根的生長及總黃酮產(chǎn)量均達(dá)到最大值[32]。

一些研究表明，光照對毛狀根生長與合成產(chǎn)物的影響隨著植物種類的不同而有所差異[33]。光質(zhì)和光照強(qiáng)度都會對次生代謝產(chǎn)物合成和積累產(chǎn)生影響。紫外線輻射已被證明是一種用來刺激植物次級代謝產(chǎn)物積累的有效誘導(dǎo)子。焦嬌[34]研究了紫外線(UV-A、UV-B、UV-C)對黃芪毛狀根次生代謝產(chǎn)物異黃酮和皂苷積累的影響，檢測發(fā)現(xiàn)UV-B輻射量在86.4 kJ/m2時，總異黃酮產(chǎn)量是對照組的2.29倍；為54 kJ/m2時，總皂苷產(chǎn)量是對照組的1.30倍。Huang等[35]對苦蕎麥毛狀根進(jìn)行UV-B脅迫處理發(fā)現(xiàn)蘆丁積累量顯著增加，是對照組的5.18倍；但是槲皮素的積累量僅為對照組的2倍。Yu等[31]研究了6種不同光照條件對人參毛狀根中人參皂苷積累的影響，發(fā)現(xiàn)在熒光燈下的毛狀根中的人參皂苷積累量增加最多。光照條件為3500 lx(18 h/d)時, 雪蓮毛狀根中總黃酮積累量比全黑暗時增加了1.6倍, 僅比全光照時增加了0.2倍[32]。

溶氧量對植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物積累也有一定的影響。如青蒿毛狀根在裝有50 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)時，其生長量和青蒿素的積累量均達(dá)到最大值[36]。在轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)水母雪蓮毛狀根，具有較高溶氧量使毛狀根生長量和總黃酮積累量均達(dá)到最大值[32]。張丹[37]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為130 r/min時，人參毛狀根鮮重和阜苷積累量均達(dá)到最大值。

2.4 誘導(dǎo)子協(xié)同作用在藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

誘導(dǎo)子的協(xié)同作用是指在誘導(dǎo)子之間存在一定的混合比例對植物毛狀根中次生代謝產(chǎn)物積累的影響效果。目前研究較多的是MJ和SA組合、YE和Ag+組合以及植物激素和其他化學(xué)誘導(dǎo)子組合。在人參毛狀根培養(yǎng)液中同時加入0.001 mmol/L MJ和SA，其皂苷含量比二者單獨作用都要高[38]。100 μmol/L MJ和SA組合是促進(jìn)雷公藤發(fā)狀根中吉堿和次堿總產(chǎn)量積累的最佳組合，分別為對照組的5.33和8.56倍[39]。100 mg/L YE和300 μmol/L Ag+組合處理丹參毛狀根時，使丹參酮Ⅰ的積累量達(dá)到最大值，是對照組的13.9倍[40]。也有學(xué)者研究了YE和Ag+組合對丹參毛狀根中丹參酮類積累的影響，結(jié)果顯示隱丹參酮積累量達(dá)到最大值時為同時期對照組的41.1倍，丹參酮ⅡA積累量達(dá)到最大值時為同時期對照組的7.4倍[41]。在植物激素和其他化學(xué)誘導(dǎo)子組合研究方面，有學(xué)者用0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L KT組合、100 μmol/L MJ和30 μmol/L SA組合以及0.5 mg/L NAA和30 μmol/L SA組合均能促進(jìn)圓葉牽牛毛狀根中咖啡酸和咖啡乙酯的積累，3個組合中0.5 mg/L NAA和30 μmol/L SA組合能使咖啡酸和咖啡乙酯積累量達(dá)到最大值[42]。

3 誘導(dǎo)子在藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用前景

隨著人們對天然藥物的高度關(guān)注和認(rèn)可，其供不應(yīng)求的現(xiàn)象日益凸顯，雖然化學(xué)合成方法也有一定的效果，但其工藝流程復(fù)雜，成本較高，易造成環(huán)境污染；而誘導(dǎo)子對藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累具有顯著作用；因此利用誘導(dǎo)子調(diào)控藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物合成已成為一個新的研究熱點。

目前雖然對大多數(shù)誘導(dǎo)子的作用機(jī)制不明確，但是利用誘導(dǎo)子作用于藥用植物毛狀根來促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累的技術(shù)迅猛發(fā)展并得到大規(guī)模應(yīng)用，在毛狀根培養(yǎng)液中添加誘導(dǎo)子高效快速地促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累已經(jīng)顯現(xiàn)出樂觀的應(yīng)用前景，這不僅提高了藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，還降低了生產(chǎn)成本、取得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。這些研究為綜合利用誘導(dǎo)子生產(chǎn)藥用成分提供了科學(xué)案例和實驗方案。