許恒正， 吳志猛， 程孝中

(1. 滁州城市職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)部， 滁州 239000； 2. 江南大學(xué) 教育部糖化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122; 3. 合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601)

迄今為止，神經(jīng)退行性疾病還缺乏有效的療法。針對每種特定神經(jīng)退行性疾病的一線療法尚在研究之中，如表觀遺傳療法、基因療法、干細(xì)胞療法，甚至3-D類器官等。但近幾年來，單一藥物療法的EPO作為治療劑在神經(jīng)退行性疾病中的作用成為研究熱點(diǎn)。

促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin， EPO) 化學(xué)本質(zhì)為糖蛋白，屬于一類細(xì)胞因子，其主要功能為促進(jìn)骨髓中的紅系祖細(xì)胞增殖、分化為成熟的紅細(xì)胞[1]。近幾年來，越來越多的證據(jù)顯示，EPO在血管生成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮了重要作用，這些作用表明EPO具有潛在的保護(hù)作用，如對心血管、腎臟、干細(xì)胞及神經(jīng)系統(tǒng)方面的保護(hù)作用[2]。

1 EPO的分子結(jié)構(gòu)及神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理

EPO基因位于第7號染色體上，編碼前體的EPO蛋白由193個氨基酸組成，其中27個氨基酸殘基作為前導(dǎo)分泌肽在形成成熟的EPO時被切除，C末端的精氨酸也除去，最終形成165個氨基酸構(gòu)成的成熟糖蛋白EPO，相對分子質(zhì)量為 30.4 ku[3]。分子中共有4個糖基化位點(diǎn)，其中3個為N-連接糖基化位點(diǎn)(Asn24，Asn38，Asn83)，1個為O-連接糖基化(Ser126)位點(diǎn)。EPO中第33位和29位、第161位和7位的半胱氨酸側(cè)鏈巰基形成2對二硫鍵，最終EPO呈α螺旋構(gòu)象(圖1)[4]。

圖1 EPO的分子結(jié)構(gòu)

EPO通過與促紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin receptor， EPOR)結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。EPOR屬于整合膜蛋白，以單體形式存在，包括由225個氨基酸組成的胞外結(jié)構(gòu)域、23個氨基酸構(gòu)成的跨膜結(jié)構(gòu)域和235個氨基酸組成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[5]，胞外結(jié)構(gòu)域包括D1和D2兩個EPO結(jié)合結(jié)構(gòu)域。EPO與EPOR結(jié)合后，引起EPOR構(gòu)象發(fā)生改變，EPOR同源二聚化從而引起胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上結(jié)合的JAK2酪氨酸激酶被活化，活化的JAK2激酶磷酸化下游激酶，從而引起多個下游信號通路活化(圖2-A)[6]。這些信號通路主要有轉(zhuǎn)錄因子5(STAT5) 、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/Akt)等[7]。EPO還可以通過EPOR單體作用方式進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2-B)。

2 EPO對神經(jīng)退行性疾病的作用

2.1 帕金森病

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是第二大最常見的神經(jīng)退行性疾病。它的癥狀主要是運(yùn)動遲緩，震顫和肢體僵硬[8]。兩個主要的病理標(biāo)志是多巴胺能神經(jīng)元的凋亡和α突觸核蛋白聚集，這些聚集加劇神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)力和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞毒性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在許多體內(nèi)或體外的PD模型中，EPO均表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。例如，被EPO與1-甲基-4-苯基吡啶鎓共同處理的交感神經(jīng)細(xì)胞PC12表現(xiàn)出良好的生存狀態(tài)，而PC12細(xì)胞經(jīng)6-羥基多巴胺預(yù)處理，再給予EPO刺激，PC12細(xì)胞的生存狀態(tài)同樣得到改善。EPO的神經(jīng)保護(hù)作用主要是通過抑制α突觸核蛋白聚集導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞氧化、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)[10]。

A： EPOR同源二聚化；B： EPOR單體與βcR受體相互作用

EPO可以抑制不同神經(jīng)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞)的炎癥反應(yīng)，從而抑制神經(jīng)退行性變化[11]。例如，炎癥反應(yīng)所釋放的炎癥因子往往導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞腫大，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷模型中，一種依賴于MAPK通路的水孔蛋白AQP4會大量表達(dá)，而重組的EPO可以下調(diào)AQP4表達(dá)，從而緩解細(xì)胞腫大，其主要依賴的信號通路則為MAPK途徑，但EPO下調(diào)AQP4表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚[12]。而在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型中， EPO則是通過降低中間絲蛋白表達(dá)量從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞肥大，降低神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[13]。這說明在不同類型神經(jīng)細(xì)胞中，EPO的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理也是不一樣的。另外一種EPO調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的機(jī)制則是通過TNF-α實(shí)現(xiàn)，在魚藤酮和6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD動物模型中，EPO顯著降低TNF-α的水平，恢復(fù)了PD大鼠體內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)水平，此處EPO通過活化Akt信號，調(diào)節(jié)NF-κB p65亞基降低炎癥因子TNF-α的表達(dá)，從而實(shí)施神經(jīng)保護(hù)作用[14-15](圖3)。另外，內(nèi)源性的EPO(如由神經(jīng)前體細(xì)胞分泌的EPO)同樣能夠緩解早期炎癥，促進(jìn)PD小鼠模型中的神經(jīng)元的存活，并能恢復(fù)TH水平[16-17]。

神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是PD一個重要的病理特征，在6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中，EPO可以抑制6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元毒害作用。EPO與EPOR結(jié)合后，通過磷酸肌醇-3激酶途徑(PI3K)活化Akt，抑制下游凋亡相關(guān)分子caspase 9/3表達(dá)和核酸內(nèi)切酶活性，從而抑制DNA斷裂，最終達(dá)到抗凋亡作用(圖3)。此外，EPO也可以經(jīng)過ERK1/2途徑實(shí)現(xiàn)抗凋亡作用，但該途徑在PD模型中并不常見[18-19]。

由此可見，EPO在PD模型中的神經(jīng)保護(hù)主要通過EPO/EPOR下游不同信號通路來下調(diào)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子，以達(dá)到緩解神經(jīng)細(xì)胞因α突觸核蛋白聚集所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激目的，而氧化應(yīng)激可以認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡上游事件。另外，此處涉及到的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡通路也是經(jīng)典的作用途徑，EPO是否可以影響其他非經(jīng)典途徑并不清楚，這也為我們繼續(xù)探索EPO在PD中的保護(hù)機(jī)制提供了一個新的視角。

2.2 阿爾茨海默氏病

阿爾茨海默氏病(AD)即為常見的老人癡呆癥，臨床特征為逐漸喪失記憶和認(rèn)知功能下降。到目前為止，尚未找到AD的治愈方法，因此，評估諸如EPO之類的新方法和新分子的治療潛力具有重要意義。多項(xiàng)研究顯示EPO在AD治療方面表現(xiàn)較好，如在細(xì)胞水平上，EPO在PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞中能夠抑制細(xì)胞凋亡和減輕Aβ聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用[20]。AD疾病在細(xì)胞水平上的重要標(biāo)志是存在于細(xì)胞外的淀粉樣蛋白(Aβ)大量聚集，影響了神經(jīng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致陽離子大量進(jìn)入細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，EPO主要通過阻止凋亡途徑相關(guān)分子的活化，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)[21]。

被EPO活化后的EPOR激活JAK / STAT，并磷酸化下游RAS和PI3K途徑。其中的RAS途徑的激活可以促進(jìn)細(xì)胞核中Bcl家族蛋白大量表達(dá)(如Bcl2和Bcl-xL)，Bcl2和Bcl-xL可以阻止凋亡蛋白半胱氨酸激酶caspase的活性[22-23](圖3)。EPO這種作用已通過siRNA技術(shù)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中得到證明，另外，使用PC12細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)也證明了EPO對Aβ誘導(dǎo)的毒性的神經(jīng)保護(hù)作用[24]。在Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型中，EPO是通過STAT下游的另一條途徑PI3K/AKT實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)，EPO通過PI3K/AKT途徑抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的磷酸化。正常情況下，活化的GSK-3β可以促進(jìn)凋亡蛋白caspase釋放[24-25](圖3)。

在小膠質(zhì)細(xì)胞系EOC2模型中，EPO抗凋亡作用則與Wnt1和PI3K介導(dǎo)的途徑相關(guān)[26]。Wnt1通過維持線粒體膜電位，促進(jìn)Bad從線粒體到細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Bad/Bcl-xL復(fù)合物的形成并增加Bcl-xL/Bax復(fù)合物來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，阻止caspase 1和caspase 3的激活[3](圖3)。在小膠質(zhì)細(xì)胞中施用EPO(10 ng / mL)可以顯著維持Wnt1的表達(dá)，這可能是防止Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的另一種保護(hù)機(jī)制[27]。

AD與PD在病理特征上具有一定的相似性，在AD中，神經(jīng)細(xì)胞因胞外淀粉樣蛋白大量聚集而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。因此，EPO在AD中的保護(hù)機(jī)制和在PD中特別類似，主要也是通過EPO/EPOR下游不同信號途徑來抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，例如，通過磷酸肌醇-3激酶途徑(PI3K)活化Akt，抑制下游凋亡相關(guān)分子caspase。

圖3 EPO神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制有關(guān)通路

2.3 脊髓損傷

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是由高強(qiáng)度創(chuàng)傷所導(dǎo)致，其特征是嚴(yán)重的神經(jīng)功能從感覺喪失到部分或完全肢體麻痹。創(chuàng)傷釋放有毒物質(zhì)，如自由基、脂質(zhì)過氧化物酶、類花生酸和谷氨酸，最終導(dǎo)致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[28]。在體外和體內(nèi)都證明了EPO的神經(jīng)保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制主要有抗凋亡、抗氧化和抗炎癥作用[29]。

脊髓損傷主要是由物理性創(chuàng)傷所導(dǎo)致，會釋放大量的氧自由基，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。EPO緩解SCI的機(jī)制之一就是抑制細(xì)胞氧化毒性作用，核因子Nrf2信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的抵御外源性刺激物的抗氧化應(yīng)答反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥和氧化應(yīng)激下，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)入核調(diào)控細(xì)胞保護(hù)酶(如NADPH、GST)大量表達(dá)，從而緩解細(xì)胞氧化和炎癥，外源給予重組EPO可以激活Nrf2信號通路[30](圖3)。

2.4 腦缺血

缺血性中風(fēng)通常是由于腦動脈血栓或局部血栓形成的閉塞引起的，從而引起急性缺血性中風(fēng)。缺血性損傷可以使ATP減少，Na+/K+泵和ATPase遭到破壞，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的離子動態(tài)失衡。后期一氧化氮的釋放、質(zhì)膜的破壞和促炎性細(xì)胞因子釋放均會使神經(jīng)興奮性毒性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致凋亡分子(caspase)激活。因此，caspase激活，特別是在神經(jīng)元凋亡過程中過表達(dá)的caspase 3可能是缺血性損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因[31]。

正常情況下，腦中EPO和EPOR的表達(dá)極少，但是在諸如缺血的損傷情況下，在內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)HIF被激活，導(dǎo)致下游分子EPO表達(dá)上調(diào)[32]。如在經(jīng)歷腦缺血的海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元中， EPO預(yù)處理大腦皮層細(xì)胞能夠激活抗凋亡基因(如XIAP和c-IAP2)，表明EPO參與抗凋亡和細(xì)胞恢復(fù)作用[33]。

與其他神經(jīng)退行病變類似，EPO在腦缺血中的保護(hù)機(jī)制也涉及到抗炎癥作用。在兔的模型中，重組的EPO在大腦缺血期間具有神經(jīng)保護(hù)作用，同時壞死皮質(zhì)神經(jīng)元明顯減少[34]，EPO募集白細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子(IL-6和TNF)，這表明EPO可以減輕局部缺血引起的炎癥反應(yīng)。

腦缺血和脊髓損傷都是由外在突發(fā)的、有一定物理強(qiáng)度的創(chuàng)傷導(dǎo)致的神經(jīng)病變，引起的細(xì)胞損傷主要還是細(xì)胞膜損傷、氧化應(yīng)激為主導(dǎo)的事件。因此，相對于慢性進(jìn)展的AD和PD來說，EPO在SCI和腦出血模型中通過經(jīng)典的Nrf2信號通路來抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及非經(jīng)典的抗凋亡基因XIAP和c-IAP2來抑制細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論與展望

EPO作為一種安全用藥在臨床已經(jīng)應(yīng)用了20多年，主要用于腎臟疾病、腫瘤等導(dǎo)致的惡性貧血治療。最近幾十年，大量動物試驗(yàn)證實(shí)，EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，并得到廣泛認(rèn)可，但在臨床研究中，EPO的治療效果并不完全受到肯定，其在臨床神經(jīng)疾病方面的治療仍然存在一些爭議，如靜脈注射EPO 對彌漫性軸索損傷的患者進(jìn)行治療時，血液中紅細(xì)胞數(shù)量并未改善。因此，對EPO在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)，為EPO在臨床神經(jīng)疾病方面的治療提供理論支撐。

EPO另一個發(fā)展方向?yàn)镋PO衍生物在神經(jīng)疾病方面的治療作用，如氨甲?；疎PO(EPO部分氨基酸被氨甲酰化修飾)，它與EPO的作用機(jī)制不同，選擇性地與βCR 異源二聚體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。此外，EPO本身的糖基化位點(diǎn)也是發(fā)展EPO衍生物的關(guān)鍵部位。因此，EPO衍生物通過不同的作用機(jī)制可以克服EPO在治療神經(jīng)疾病方面的一些缺陷，提高治療效果，其作用機(jī)制和藥物活性方面是將來值得探索的領(lǐng)域。