王 飛，楊繼鑫，陳智年，張永喜

1)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院普外二科 河南新鄉(xiāng) 453000:

2)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲乳血管外科 西安 710000 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 河南新鄉(xiāng) 453000

結(jié)直腸癌是第三大常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，其在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高[1]。近幾十年來隨著篩查和治療手段的進(jìn)步，結(jié)直腸癌患者的生存率有所提高，但晚期結(jié)直腸癌患者的生存率只有5%[2]。因此探究結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，從而尋找治療的新方法是提高患者生存率的重要途徑。原鈣黏蛋白10(protocadherin 10，PCDH10)是近年來新發(fā)現(xiàn)的基因，位于4q28.3染色體上，其編碼的蛋白與細(xì)胞間黏附、細(xì)胞分化以及細(xì)胞間信息傳遞等過程密切相關(guān)[3]。多項研究[4-6]表明，PCDH10的異常表達(dá)及其啟動子異常甲基化在乳腺癌、宮頸癌、肝癌等人類多種惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，PCDH10在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)。本研究觀察了過表達(dá)PCDH10對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，為探索結(jié)直腸癌治療的新靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、HT29、LoVo、HCT116和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460均購于中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，特級胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶和MTT試劑購于美國Sigma公司，TRIzol試劑和慢病毒購于美國Invitrogen公司，pcDNA-PCDH10過表達(dá)重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(質(zhì)粒慢病毒包裝由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Primix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，鼠抗人PCDH10抗體、鼠抗人PCNA抗體、鼠抗人MMP-2抗體、鼠抗人GAPDH抗體和山羊抗鼠二抗均購于美國CST公司，Transwell小室購于美國Millipore公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌SW620、HT29、LoVo、HCT116細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長且生長密度達(dá)80%以上時，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.3結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中PCDH10mRNA表達(dá)水平的檢測分別提取結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、HT29、LoVo、HCT116和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。PCDH10上游引物5’-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3’，下游引物5’-GTCTGTCAACTAGATAGCTG-3’； β-actin上游引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算PCDH10 mRNA的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.4SW620細(xì)胞實驗分組將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞接種于96孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用含pcDNA-PCDH10(PCDH10組)和空載質(zhì)粒(陰性對照組)的慢病毒感染SW620細(xì)胞(滴度為108TU/mL)，48 h后篩選穩(wěn)定表達(dá)PCDH10的細(xì)胞株。同時設(shè)未感染的SW620細(xì)胞為對照(空白對照組)。

1.5 3組SW620細(xì)胞中PCDH10mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測分別收集處于對數(shù)生長期的3組SW620細(xì)胞，同1.3方法檢測PCDH10 mRNA的表達(dá)。另取SW620細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，加入等體積的上樣緩沖液，加熱10 min致蛋白變性，配制100 g/L SDS-PAGE，按50 μg/孔蛋白樣品加樣，電泳分離蛋白后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，在100 g/L脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h。加入按1∶1 000稀釋的PCDH10一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入按1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，曝光并拍照。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)水平為目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值。實驗重復(fù)3次。

1.6 3組SW620細(xì)胞PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)水平的檢測取各組SW620細(xì)胞，同1.5中方法采用Western blot法檢測細(xì)胞中PCNA和MMP-2蛋白的表達(dá)，其中PCNA一抗和MMP-2一抗均按1∶1 000稀釋。實驗重復(fù)3次。

1.7 3組SW620細(xì)胞增殖情況檢測分別取3組SW620細(xì)胞接種于96孔板，接種密度約2×103個/孔，待細(xì)胞貼壁后24、48、72、96 h向每孔細(xì)胞中添加20 μL 5 g/L MTT溶液，37 ℃孵育4 h，除去上清液，再每孔加入100 μL二甲基亞砜，混勻，避光振蕩反應(yīng)10 min，最后使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的光密度(OD)值，實驗重復(fù)3次。

1.8 3組SW620細(xì)胞克隆形成能力檢測取對數(shù)生長期的各組SW620細(xì)胞，以5×102個/孔接種到6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d左右肉眼可觀察到細(xì)胞克隆，棄去舊培養(yǎng)液，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，1 g/L結(jié)晶紫染色30 min，清水緩慢洗滌2次，風(fēng)干后在顯微鏡(×40)下選取5個視野，觀察并計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)，以細(xì)胞克隆形成數(shù)表示克隆形成能力。實驗重復(fù)3次。

1.9 3組SW620細(xì)胞遷移能力檢測收集各組SW620細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液饑餓處理24 h，收集細(xì)胞并制成2×105個/mL的細(xì)胞懸液。將孔徑為8 μm的Transwell小室放置在24孔板中，取200 μL細(xì)胞懸液添加到Transwell小室的上室，下室中加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，將小室置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培育48 h。取出小室，用棉簽拭去上室細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定20 min，1 g/L結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌小室2次，風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察并計數(shù)穿過小室的細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較不同細(xì)胞間PCDH10 mRNA表達(dá)水平以及3組SW620細(xì)胞增殖和遷移能力，PCDH10 mRNA和蛋白，PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中PCDH10mRNA表達(dá)水平的比較結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、HT29、LoVo、HCT116中PCDH10 mRNA的表達(dá)水平分別為(0.11±0.01)、(0.43±0.04)、(0.36±0.04)及(0.29±0.03)，均低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460(1.00±0.10)(F=119.229,P<0.001)，且在SW620細(xì)胞中最低，因此后續(xù)選擇SW620細(xì)胞進(jìn)行PCDH10功能探究實驗。

2.2 3組SW620細(xì)胞中PCDH10mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖1和表1。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，PCDH10組SW620細(xì)胞中PCDH10 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。

2.3 3組SW620細(xì)胞中PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖2和表2。與陰性對照組和空白對照組比較，PCDH10組SW620細(xì)胞中PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和PCDH10組

表1 3組SW620細(xì)胞中PCDH10 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和PCDH10組

表2 3組SW620細(xì)胞中PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 3組SW620細(xì)胞增殖和遷移能力的比較結(jié)果見表3。與陰性對照組和空白對照組比較，PCDH10組SW620細(xì)胞OD值在48、72、96 h降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。

表3 3組SW620細(xì)胞增殖和遷移能力的比較(n=3)

3 討論

已有研究[8]證實，PCDH10調(diào)節(jié)的細(xì)胞黏附作用與多數(shù)腫瘤的形成密切相關(guān)。近年來，隨著對PCDH10基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，其在腫瘤組織和細(xì)胞中多表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)或失活，作為抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、生長、侵襲和遷移等多種生物學(xué)行為[9-10]。Ye等[11]研究顯示，PCDH10在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，而PCDH10的表達(dá)上調(diào)可抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。林瑩等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PCDH10的低表達(dá)與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)，提示其可能成為預(yù)測胃癌患者預(yù)后的輔助指標(biāo)之一。另有研究[13]報道，在胰腺癌細(xì)胞中PCDH10的表達(dá)水平下降，而過表達(dá)PCDH10可抑制胰腺癌BXPC-3細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞比較，PCDH10 mRNA在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，提示PCDH10在結(jié)直腸癌中亦發(fā)揮抑癌基因作用。為進(jìn)一步探究PCDH10在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的作用，本實驗選擇結(jié)直腸癌細(xì)胞中PCDH10表達(dá)水平最低的SW620細(xì)胞為研究對象，通過感染含PCDH10過表達(dá)重組載體的慢病毒，構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)PCDH10的SW620細(xì)胞。結(jié)果顯示，過表達(dá)PCDH10能夠降低SW620細(xì)胞增殖及克隆形成能力，抑制SW620細(xì)胞遷移能力，提示PCDH10基因可能在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。該實驗結(jié)果與上述研究[9-13]相似。PCNA只存在于腫瘤細(xì)胞和處于增殖的細(xì)胞中，與細(xì)胞中DNA的合成有關(guān)，具有啟動細(xì)胞增殖的作用，目前已將其作為反映細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)之一[14]。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，目前研究[15]表明其與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PCDH10的SW620細(xì)胞中PCNA和MMP-2蛋白的表達(dá)水平均降低，提示PCDH10可能通過下調(diào)PCNA和MMP-2蛋白的表達(dá)抑制SW620細(xì)胞增殖和遷移。這與彭曦[16]關(guān)于PCDH10通過下調(diào)MMP-2阻礙多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移能力的研究結(jié)果一致。

總之，本研究結(jié)果顯示，PCDH10在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)PCDH10能夠抑制結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖和遷移能力，其作用機(jī)制可能與下調(diào)PCNA和MMP-2蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究PCDH10在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制提供了一定的實驗基礎(chǔ)，隨著對PCDH10基因研究的深入，PCDH10有望成為結(jié)直腸癌新的治療靶點。