歐小倩， 王 瑩， 何程實(shí)， 李春暉， 劉國(guó)慶， 楊少華

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)作為一種生物活性物質(zhì)，對(duì)人和動(dòng)物有重要的生理功能。其中，n-6和n-3多不飽和脂肪酸在人和動(dòng)物體內(nèi)都發(fā)揮著重要作用，作為合成類二十烷酸化合物的前體共同調(diào)節(jié)生物體的生命活動(dòng)，廣泛參與脂類代謝調(diào)控基因表達(dá)、穩(wěn)定細(xì)胞膜功能及促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等[1-2]。多不飽和脂肪酸在多種生理過程中起著至關(guān)重要的作用，它們作為生物膜的主要成分參與結(jié)構(gòu)功能[3]、代謝能的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子的配體和細(xì)胞通路中的信使[4]。多不飽和脂肪酸可由膳食提供，還可以由必需脂肪酸亞油酸和亞麻酸在體內(nèi)通過一系列去飽和及碳鏈延長(zhǎng)過程獲得。對(duì)于禽類而言，多不飽和脂肪酸的含量直接影響肉質(zhì)風(fēng)味[5]。肉品嫩度是衡量肉質(zhì)的重要因素，肌內(nèi)脂肪對(duì)肉嫩度的影響較大。多不飽和脂肪酸能促進(jìn)脂肪降解，減少體脂沉積[6]，因此多不飽和脂肪酸通過降低嫩度影響肉質(zhì)風(fēng)味。

相關(guān)研究表明，不飽和脂肪酸對(duì)脂肪合成具有抑制作用，增加不飽和脂肪酸比例會(huì)增加脂肪氧化酸敗程度，導(dǎo)致肉品質(zhì)下降[7]。截至目前，關(guān)于調(diào)控家禽脂肪酸含量機(jī)理的研究尚少，因此開展這方面的研究具有重要意義。前期通過候選基因分析策略，雖然找到了一些影響雞肉品質(zhì)的主效基因(例如脂肪酸合成酶(FASN)、超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶6(ELOVL6)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)等)，但很多關(guān)鍵基因還無(wú)法得到分離和鑒定, 因此高通量檢測(cè)的研究手段刻不容緩?；诖?，本課題組前期通過對(duì)具有極端高、低多不飽和脂肪酸比率的黃山黑雞腿肌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，整合差異表達(dá)基因、己報(bào)道的影響雞肉脂肪酸代謝的QTL及基因的生物學(xué)功能分析，從而確定FADS2為影響肌肉中多不飽和脂肪酸含量的候選基因。

脂肪酸脫氫酶(FADS)是一類催化脂肪酸?；溙囟ㄎ恢肅—C脫氫形成C=C的脫氫酶家族，能夠催化脂肪酸生成多不飽和脂肪酸[8]。脂肪酸脫氫酶2(FADS2)是脂肪酸脫氫酶家族成員之一，是多不飽和脂肪酸合成代謝途中關(guān)鍵的限速酶。在生物體內(nèi)，具有維持膜的正確結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)脂肪酸代謝等重要作用。FADS2基因可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，從而影響雞肉的肉質(zhì)風(fēng)味[9]。文獻(xiàn)[10]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變會(huì)對(duì)中國(guó)荷斯坦牛乳中脂肪酸組成產(chǎn)生重要影響；文獻(xiàn)[11]在對(duì)雞的研究中發(fā)現(xiàn)，雞FADS2基因5′側(cè)翼區(qū)的G-997C和C-1402T 2個(gè)突變位點(diǎn)影響肌肉脂肪酸的含量，并且對(duì)雞前期生長(zhǎng)速度影響較大。文獻(xiàn)[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADS2基因3′UTR區(qū)部分SNP突變及其單倍型對(duì)乳中脂肪酸含量具有顯著影響。

鑒于FADS2基因在畜禽脂肪酸代謝方面的重要作用，本文通過慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)載體干擾沉默雞前脂肪細(xì)胞中的FADS2基因，篩選FADS2基因影響脂肪酸代謝的相關(guān)下游基因，從而探究FADS2基因?qū)﹄u脂肪酸代謝的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

雞前脂肪細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng);雞前脂肪細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽有限公司；25 cm培養(yǎng)瓶、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；293T細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G購(gòu)于蘇州吉瑪；Lentivirus-病毒液購(gòu)自Genepharma；RNAi-Mate 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自蘇州吉瑪；總RNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量通用試劑(Cat# GMRS-001 吉瑪, 上海)。

1.2 方法

1.2.1 雞前脂肪細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

雞前脂肪細(xì)胞的分離參照文獻(xiàn)[13-14]。將消化分離出來(lái)的細(xì)胞稀釋并吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/cm2的密度接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗3～5次，除去未貼壁的細(xì)胞之后每1～2 d換1次培養(yǎng)液，并觀察拍照。

1.2.2 shRNA干擾序列的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)RNAi設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)雞FADS2基因的RNA干擾片段FADS2-shRNA，由蘇州吉瑪公司合成處理，序列信息見表1所列。

表1 設(shè)計(jì)合成的shRNA序列信息

1.2.3 shRNA有效片段篩選

將雞前脂肪細(xì)胞消化后接種于24孔板中，待細(xì)胞達(dá)到60%左右匯合度時(shí)，分別加入慢病毒FADS2-259(F1)、FADS2-498(F2)、FADS2-618 (F3)，同時(shí)以空病毒載體作為對(duì)照組。48 h收集細(xì)胞，提取總RNA，參照試劑盒說明提取，用于熒光定量檢測(cè)FADS2的干擾效率。引物設(shè)計(jì)見表2所列。

表2 引物相關(guān)信息

1.2.4 FADS2基因的干擾實(shí)驗(yàn)

將篩選得到的一組有效干擾FADS2的shRNA，同上述操作，感染雞前脂肪細(xì)胞，提取總RNA，用于熒光定量檢測(cè)FADS2干擾效率。

1.2.5 基因表達(dá)檢測(cè)

將檢驗(yàn)合格后的雞脂肪細(xì)胞RNA根據(jù)其測(cè)得的濃度分別取3 μg來(lái)構(gòu)建RNA池，用于轉(zhuǎn)錄組的文庫(kù)構(gòu)建。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析陰性對(duì)照(NC)組及干擾(GR)組中差異表達(dá)基因。

1.2.6 構(gòu)建cDNA文庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組序列

樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠，通過A-T互補(bǔ)配對(duì)與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集真核生物的mRNA。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)富集得到最終的cDNA文庫(kù)。建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。獲得原始測(cè)序序列后，通過去除帶接頭的reads，去除N(N表示無(wú)法確定堿基信息)的比例大于10%的reads和低質(zhì)量的reads，獲取clean reads。之后，使用HISAT軟件將獲取的clean reads進(jìn)行基因組定位分析。

1.2.8 差異表達(dá)及功能富集分析

使用DESeq R軟件包(1.10.1)對(duì)NC(control)組和干擾(GR)組進(jìn)行差異表達(dá)分析。將|lb Ratio|≥1和FDR≤0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)閾值。篩選差異表達(dá)基因后，通過基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。以P≤0.05為閾值，篩選滿足此閾值的差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 FADS2基因干擾效率檢測(cè)

熒光定量檢測(cè)FADS2基因干擾效率如圖1所示，圖1中，B表示空白對(duì)照組；NC表示陰性對(duì)照組；F1表示干擾片段1；F2表示干擾片段2；F3表示干擾片段3。

圖1 熒光定量檢測(cè)FADS2基因干擾效率

以B組為校準(zhǔn)，ACTB為內(nèi)參，F(xiàn)ADS2基因的表達(dá)水平定量結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，F(xiàn)1、F2、F3組FADS2的mRNA表達(dá)水平分別降低了60%、34%、4%。根據(jù)篩選干擾片段的條件(干擾效果>50%)，F(xiàn)1片段已經(jīng)達(dá)到有效的干擾效果，因此可以用于后續(xù)的檢測(cè)試驗(yàn)。

2.2 FADS2基因干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將有效干擾片段F1轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后的圖片(放大100倍)如圖2所示。

圖2 轉(zhuǎn)染效率熒光情況

由圖2可知，轉(zhuǎn)染效率在70%左右，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。

2.3 雞前脂肪細(xì)胞的RNA測(cè)序

干擾組1(GR 1)、干擾組2(GR 2)、陰性對(duì)照組1(Control 1)和陰性對(duì)照組2(Control 2)測(cè)序序列經(jīng)過測(cè)序數(shù)據(jù)過濾后，共獲得清晰讀取數(shù)據(jù)232 535 kB，每個(gè)樣本的平均數(shù)為58 134 kB(范圍是50 794～65 430 kB)，詳細(xì)信息見表3所列。

表3 每個(gè)樣品的基本測(cè)序數(shù)據(jù)

2.4 差異表達(dá)基因的鑒定

使用RPKM方法，檢查了NC(control)組和干擾(GR)組之間的差異表達(dá)基因表達(dá)譜。NC(control)組和干擾(GR)組共檢測(cè)到190個(gè)差異表達(dá)基因，其中65個(gè)基因下調(diào)(左邊部分)，125個(gè)基因上調(diào)(右邊部分)，NC(control)組和干擾(GR)組火山圖如圖3所示。使用RNA-Seq和基因功能的綜合分析，篩選出FADS2可能的11個(gè)下游基因，見表4所列。

圖3 差異表達(dá)基因的火山圖

表4 FADS2調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的11個(gè)下游基因

2.5 差異表達(dá)基因的功能富集分析

通過DAVID生物信息學(xué)資源進(jìn)行了GO通路富集分析。結(jié)果顯示，與脂肪酸代謝過程有關(guān)的8個(gè)GO生物過程項(xiàng)顯著富集(P<0.05)。其中包括對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)(GO:0033993)，膜脂質(zhì)生物合成過程(GO:0046467)，細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)(GO:0071396)，甘油脂生物合成過程(GO:0045017)，蛋白質(zhì)脂化(GO:0006497)，甘油磷脂生物合成過程(GO:0046474)，甘油脂生物合成過程(GO:0045017)，脂蛋白生物合成過程(GO:0042158)，詳細(xì)信息見表5所列。

表5 差異表達(dá)基因的GO分析

2.6 下游基因

通過綜合分析差異表達(dá)基因、通路富集和基因功能，本文可以鑒定出STAT1、LY86、FABP5、OGFR、ACTA1、SLC5A6、NCOA7、KLF2、KLF4、ACSL5和FABP3可能是FADS2基因影響脂肪酸代謝的11個(gè)下游基因，具體信息詳見表4所列。

3 討 論

近年來(lái)，RNA-Seq已經(jīng)成為研究基因表達(dá)分析轉(zhuǎn)錄譜的有力工具[15]。作為轉(zhuǎn)錄組研究工具的新方法，RNA-Seq是一種高度敏感和準(zhǔn)確的檢測(cè)手段[16]。在雞中，RNA-Seq已成功應(yīng)用于雞肉味器官的分析[17]、篩選差異表達(dá)的基因[18]、不同的脂肪酸生物合成機(jī)制[19]和胸肌剪切力[20]等研究。本研究將雞前脂肪細(xì)胞中的FADS2基因干擾沉默后，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選出FADS2影響的相關(guān)下游基因，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究開展了3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，避免了實(shí)驗(yàn)的偶然性，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究利用RNA干擾技術(shù)，通過慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)載體干擾沉默雞前脂肪細(xì)胞中的FADS2基因[21-22]。本實(shí)驗(yàn)所用慢病毒載體是以第三代載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過一定改建，構(gòu)成四質(zhì)粒體系。同時(shí)，采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制和轉(zhuǎn)移，從而確保產(chǎn)生的慢病毒具備良好的生物安全性。與常規(guī)的原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒包裝載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)70%，極大地提高了轉(zhuǎn)染的效率。

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)干擾結(jié)果，共檢測(cè)到190個(gè)差異表達(dá)基因。其中11個(gè)基因受FADS2基因的調(diào)節(jié)，包括STAT1、LY86、FABP5、OGFR、ACTA1、SLC5A6、NCOA7、KLF2、KLF4、ACSL5和FABP3。其中，脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)是一種參與長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸代謝的小分子蛋白[23]，并且能夠協(xié)助動(dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)。

脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)和脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族(FABPs)，是一種胞內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)載體[24]，在本研究中均顯著下調(diào)。文獻(xiàn)[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP5對(duì)硬脂酸和亞油酸具有高度親和力，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)控脂質(zhì)代謝。文獻(xiàn)[26]將FABP5基因轉(zhuǎn)到田鼠中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP5基因在脂肪細(xì)胞中過表達(dá)會(huì)加快脂肪分解代謝。另一個(gè)脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員FABP3基因，參與胞內(nèi)脂肪酸的短暫存儲(chǔ)和運(yùn)輸[27]。文獻(xiàn)[28]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因能結(jié)合脂肪酸等疏水性分子或有機(jī)陰離子。文獻(xiàn)[29]在研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因遺傳信息的變化會(huì)直接或間接調(diào)控羊奶成分與脂肪酸的組成。因此，F(xiàn)ABP5、FABP3基因可能通過調(diào)節(jié)雞前脂肪細(xì)胞中脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和遺傳調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝。

同樣ACTA1、SLC5A6、KLF2、KLF4和LY86基因的表達(dá)水平在雞前脂肪細(xì)胞中也顯著下調(diào)。骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白1(ACTA1)主要分布在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)，文獻(xiàn)[30]在對(duì)延邊黃牛的研究中發(fā)現(xiàn)，ACTA1基因的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)，該基因可能參與延邊黃牛脂肪沉積的調(diào)控。溶質(zhì)載體家族5成員6(SLC5A6)會(huì)產(chǎn)生人鈉依賴性多種維生素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hSMVT)，hSMVT在多種細(xì)胞系統(tǒng)中介導(dǎo)脂肪酸攝取[31]。

KLFs家族參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化，并在脂肪細(xì)胞的增殖分化調(diào)控中也有作用。其中，KLF2在脂肪細(xì)胞分化中具有重要的調(diào)控作用。文獻(xiàn)[32]研究發(fā)現(xiàn)，KLF2基因在牦牛肺臟和脂肪組織中的表達(dá)水平最高，并且在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)。文獻(xiàn)[33]對(duì)雞KLF2基因的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，KLF2基因是雞脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子，可以通過抑制PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)從而抑制脂肪細(xì)胞分化[34]。KLF4基因是參與脂肪代謝和脂肪組織形成的主要基因[35]。以上的諸多研究均與本研究的結(jié)果相吻合。然而，截至目前，沒有研究將LY86與脂肪酸代謝聯(lián)系起來(lái)，因此對(duì)該基因的進(jìn)一步研究是有必要的。

另一方面，STAT1、NCOA7、ACSL5和OGFR基因的表達(dá)水平在本研究中顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)在干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用[36]。已有研究表明，STAT1的表達(dá)水平與脂肪沉積呈正相關(guān)[37]。核受體共激活物(NCOA7)參與不同核受體(如ESR1、THRB、PPARG和RARA)的共激活作用。而PPARG是目前發(fā)現(xiàn)的在脂肪組織中調(diào)控脂肪酸代謝的核心轉(zhuǎn)錄因子[38]。?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員5(ACSL5)是長(zhǎng)鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族的同工酶，該家族所有同工酶都能將游離的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪?；o酶A脂，從而在脂質(zhì)生物合成和脂肪酸降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)[39]在研究中發(fā)現(xiàn)，ACSL5在脂肪肝發(fā)展過程中起重要作用。相關(guān)研究表明，ACSL5主要在三酰甘油合成率高的組織中表達(dá)，表明ACSL5在脂質(zhì)合成代謝中具有重要作用[40]。這些研究為本研究結(jié)果提供了佐證。然而，OGFR基因的具體生物學(xué)功能尚不清楚，需進(jìn)一步研究以了解該基因在脂肪酸代謝分子機(jī)制中的作用。

4 結(jié) 論

本研究通過慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)載體對(duì)雞前脂肪細(xì)胞中的FADS2基因干擾沉默后，有效RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共檢測(cè)到190個(gè)差異表達(dá)基因。通過綜合分析差異表達(dá)基因、通路分析和基因功能，確定STAT1、LY86、FABP5、OGFR、ACTA1、SLC5A6、NCOA7、KLF2、KLF4、ACSL5和FABP3這11個(gè)基因可能是FADS2基因影響的下游基因，為后期的研究提供了一定的理論依據(jù)。