李鈺瑩，霍亞迪，楊志青，朱慧森，董寬虎

（山西農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院，山西 太谷030801）

禾本科早熟禾屬是疏叢型或密叢型的草本植物，在我國分布約有81 種［1］。早熟禾屬植物表型多樣性豐富，多種該屬植物被開發(fā)為應用廣泛的草坪草。其中，草地早熟禾（Poa pratensis）是被引種馴化、培育和改良最早的種，亦是商品化和產(chǎn)業(yè)化最為成功、應用最廣泛的草坪草［2］。目前，我國草地早熟禾種子仍依賴進口，其育種和制種方面的工作相對滯后。對本土現(xiàn)有種質(zhì)資源進行遺傳多樣性評價，是利用本土種質(zhì)資源培育新品種的基礎，一方面可以了解種質(zhì)資源間的遺傳距離，為雜交育種或基因工程育種中親本的選擇提供數(shù)據(jù)基礎；另一方面可以利用分子標記技術對基因進行定位，通過分析與目標基因緊密相關的分子標記來判斷目標基因是否存在，縮短育種周期。

在我國，已有少數(shù)研究團隊分別利用Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）［3～6］、Intersimple Sequence Repeat（ISSR）［7～10］以及Amplified Fragment Length Polymorphism（AFLP）［11］分子標記技術對我國部分地區(qū)早熟禾屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了分析和評價，填補了我國草地早熟禾種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫的空白?，F(xiàn)有文獻中，更多的是針對我國西南地區(qū)、山西、甘肅和北京等地的草地早熟禾種質(zhì)資源抗性生理相關的研究［12～15］，以及針對甘肅、山西等地草地早熟禾種質(zhì)資源的表型性狀研究［16～18］。然而，我國缺少對草地早熟禾野生資源的關注，且無標準的評價體系能夠對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進行系統(tǒng)的分析，我國草地早熟禾野生種質(zhì)資源的開發(fā)利用任重道遠。

山西省屬于典型溫帶大陸性季風氣候［19］，地域廣闊，擁有著豐富的野生草地早熟禾種質(zhì)資源，具有改良和培育草地早熟禾新品種的巨大潛力。2009 年，圍繞山西地形地貌較為突出的五臺山、恒山、太岳山和芽廬山等地區(qū)，本研究團隊開始開展草地早熟禾的種質(zhì)資源收集工作。至今，共收集到49 份野生草地早熟禾種質(zhì)資源，并已開展農(nóng)藝性 狀 評 價［18］和 抗 性 生 理 比 較［13］等 方 面 的 研 究。ISSR 分子標記技術在種質(zhì)資源多樣性評價中，具有擴增多態(tài)性高、重復性好和操作簡便等優(yōu)點。本研究選擇商品種‘愛美（Aimyth）’作為外類群，通過ISSR 遺傳多樣性鑒定和評價技術，揭示已收集的49 份野生種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關系，旨在為山西地區(qū)草地早熟禾種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的49 份野生草地早熟禾種質(zhì)材料均采集于山西，并根據(jù)采集地的地理特征進行區(qū)域劃分，共分10 個居群，采用美國商品種‘愛美’作為外類群。本研究共計50 份試驗材料，具體來源見表1。

表1 50 份供試草地早熟禾樣品分組及采集地信息Table 1 Gathering information of fifty Poa pratensis samples

1.2 試驗方法

將所采集的49 份野生草地早熟禾種子及收集的1 份商品種‘愛美’在山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院試驗田進行種植。適時摘取幼嫩葉片，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB，Cetyltriethy lammonium bromide）提取樣本材料的總DNA［20］。ISSR 引物篩選時，從已知的24 條早熟禾屬常用ISSR 引物［7，8，21］中篩選出擴增譜帶較多且多態(tài)性較高的10 條引物，其具體序列詳見表2。ISSR ?PCR 反應體系為（總體積25.0 μL）：10×PCR buf?fer（2.5 μL），Mg2+（2.0 mmol·L-1），dNTP（0.2 mmol·L-1），Taq 聚 合 酶（0.5 U），Primer（0.8 μmol·L-1），DNA 模 板（1.0 ng·μL-1）。ISSR ?PCR 反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，50.4～57.1℃退火1 min，72℃延伸2 min，30 個循環(huán)，72℃后延伸7 min。ISSR?PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview 染色后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中掃描并保存圖像。

1.3 統(tǒng)計分析

本研究中草地早熟禾野外采樣點地理分布圖采用Arcgis pro 2.4 制作。ISSR?PCR 擴增產(chǎn)物產(chǎn)物電泳圖用Quantity One 4.6.2 軟件讀取譜帶，輔助人工矯正，其中有譜帶的標記為“1”，無譜帶的標記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。使用PopGen 1.32 軟件計算各居群間及樣品間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient，GS）、等 位 基 因 數(shù)（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、基因多樣性指數(shù)（Gene diversity，H）和香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon's in?formation index，I）。使 用GenAlEx 6.5 軟 件 計 算居群間多態(tài)位點比例（Percentage of polymorphic loci，PPL）。根據(jù)樣品間遺傳相似系數(shù)（GS），采用非加權平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA），使用NTSYSpc-2.10e 軟件構建親緣關系聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR 標記多態(tài)性分析

利用篩選的10 條多態(tài)性較高的ISSR 引物對50 個樣本的DNA 進行PCR 擴增，各條引物的擴增結果見表2。10 條引物共擴增出250 條清晰譜帶，每條引物擴增的譜帶數(shù)在16～34 條之間（圖1），多態(tài)性比率在87.50%～100%之間。在250 條擴增譜帶中，其中237 條譜帶具備多態(tài)性，引物多態(tài)性比率達94.80%。在10 條引物中，UBC 857、UBC 835、UBC 834 和UBC 836 的 擴 增 譜 帶 數(shù) 和多態(tài)性譜帶數(shù)較多，對本研究中草地早熟禾樣品的區(qū)分效果較好。

圖1 引物UBC 811 對50 份草地早熟禾種質(zhì)DNA 的ISSR-PCR 擴增結果Fig.1 ISSR amplification results of 50 populations of wild Poa pratensis with UBC 811

表2 ISSR 引物序列及其擴增結果Table 2 Primer sequence used in ISSR analyses and the amplified results

2.2 不同采集地草地早熟禾的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

由表3 可見，10 個野生草地早熟禾居群間的遺傳相似系數(shù)在0.580 0～0.946 7，遺傳距離在0.054 8～0.544 7。在10 個野生居群中，芽廬山居群（Group YL）和云中山居群（Group YZ）的遺傳相似系數(shù)最高，為0.946 7，來自于這兩個居群的草地早熟禾親緣關系最近。而采集于朔州市右玉縣地區(qū)的樣品（YY）與長治市屯留縣地區(qū)的樣品（TL）遺傳相似系數(shù)最小，為0.580 0，表明來自于這兩個居群的草地早熟禾親緣關系最遠。

表3 供試草地早熟禾的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 3 Genetic similarity and genetic distance between different groups of Poa pratensis collected in Shanxi

育成商品種‘愛美’與山西地區(qū)野生草地早熟禾的遺傳相似系數(shù)范圍在0.572 0～0.762 3。其中，與長治市屯留縣地區(qū)的樣品（TL）遺傳相似系數(shù)最小，為0.572 0；而與王屋山居群（Group WU）的遺傳相似系數(shù)最大，為0.762 3。

2.3 UPGMA 聚類分析

對供試種質(zhì)資源材料進行聚類分析可以分析各供試材料間親緣關系的遠近，根據(jù)山西地區(qū)野生草地早熟禾種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)構建UP?GMA 聚類圖（圖2）。本研究以遺傳相似系數(shù)0.75為閾值，將供試的10 個野生居群種質(zhì)資源樣品和1個商品種‘愛美’共分為5 個大類群。其中類群I 包含6 個居群，分別為太岳山居群（Group TY）、王屋山居群、云中山居群、芽廬山居群、恒山居群（Group HS）和太白山居群（Group TB）；類群Ⅱ包含五臺山居群（Group WT）和朔州市應縣地區(qū)（YX）的樣品；類群Ⅲ為右玉地區(qū)（YY）草地早熟禾樣品；類群Ⅳ為商品種‘愛美’；類群Ⅴ為屯留地區(qū)（TL）草地早熟禾樣品。在UPGMA 聚類分析中，王屋山居群和太岳山居群、芽廬山居群和云中山居群、恒山居群和太白山居群地理位置較近，遺傳相似性較高，兩兩聚在一起。在本聚類分析中，商品種‘愛美’與山西地區(qū)野生草地早熟禾種質(zhì)資源之間存在遺傳差異。

圖2 供試草地早熟禾種質(zhì)資源遺傳多樣性UPGMA 聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of the analyzed Poa pratensis based on genetic distance

2.4 野生草地早熟禾居群間的遺傳多樣性

進行種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析時，在10 個野生居群中，由于部分地區(qū)種質(zhì)資源豐富度較低，采集的樣品數(shù)較少，因而本研究只選擇其中采集樣品數(shù)≥3 的7 個居群進行比較分析。表4 為7 個所選擇的野生草地早熟禾居群的遺傳參數(shù)，其中等位基因數(shù)介于1.228 0～1.700 0，有效等位基因數(shù)介于1.178 3～1.430 1，基因多樣性指數(shù)介于0.097 1～0.247 0，香農(nóng)信息指數(shù)介于0.139 8～0.368 3，多態(tài)位點比例介于22.80%～70.00%，根據(jù)香農(nóng)信息指數(shù)和基因多樣性指數(shù)分析，7 個野生居群的變異水平由高到低依次為Group YL>Group WU>Group YZ>Group HS>Group TY>Group TB>Group WT，其中芽廬山居群的遺傳多樣性最高，王屋山居群次之，而五臺山居群的遺傳多樣性最低。根據(jù)以上遺傳參數(shù)的分析，山西幾個采集點間草地早熟禾種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平存在較大差異。

表4 山西地區(qū)7 個野生草地早熟禾居群的遺傳參數(shù)Table 4 Genetic parameters of the seven groups of Poa pratensis collected in Shanxi

3 討論

ISSR-PCR 分子標記法結合了微衛(wèi)星（SSRs）分子標記法和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分子標記法的優(yōu)點，從而實現(xiàn)隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分子標記法的通用性，因此被廣泛應用于研究種質(zhì)資源遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、基因標記、基因組定位和進化生物學等領域［22］。2007 年，美國學者利用8 條ISSR 引物（其引物多態(tài)性比率為96%）成功將一年生早熟禾（Poa annua）及其變種區(qū)分開，因而發(fā)現(xiàn)ISSR 分子標記法可用于草坪草品種的鑒定，甚至利用種子進行品種的鑒定［23］。對波蘭13 個野生草地早熟禾居群與3 個栽培種之間的遺傳關系研究發(fā)現(xiàn)，與RAPD 法相比，ISSR法能夠更有效、更可靠地分析草地早熟禾種質(zhì)資源的遺傳多樣性［24］。本研究中，10 條ISSR 引物的多態(tài)性比率為94.80%，ISSR 法可有效地對山西野生草地早熟禾種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析。

本研究中，7個野生草地早熟禾居群的基因多樣性指數(shù)介于0.097 1～0.247 0 間，均值為0.199 2。山西野生草地早熟禾居群的基因多樣性指數(shù)（0.199 2）高于青海地區(qū)的0.127 7［7］，低于青藏高原地區(qū)的0.300 1［10］。野生草地早熟禾種質(zhì)資源的基因多樣性指數(shù)大小很可能與樣品的采樣范圍有關，青海地區(qū)野生草地早熟禾居群采樣點緊鄰試驗區(qū)，采樣范圍較小，而青藏高原地區(qū)的野生草地早熟禾居群共計采樣60 份，分別采集于青藏高原地區(qū)的不同地理位置，采樣范圍較廣。

一個居群中種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平受其交配制度、物種進化史、居群進化史以及環(huán)境異質(zhì)性的影響［25］。本研究中五臺山居群的基因多樣性指數(shù)為0.097 1，遠低于7 個野生草地早熟禾種質(zhì)資源基因多樣性的均值。這可能是由于采樣點過于集中，亦或是現(xiàn)有樣品數(shù)量不足以表征該地區(qū)草地早熟禾的遺傳多樣性導致的。從草地早熟禾的繁殖特性來看，還有可能是該居群草地早熟禾更傾向于無性繁殖，因而使得其基因多樣性降低。

草地早熟禾是四倍體植物，還是兼性無融合生殖植物，特殊的遺傳背景和生殖特征使得草地早熟禾的遺傳結構較為復雜。在本研究中，山西地區(qū)草地早熟禾的遺傳相似系數(shù)為0.580 0～0.946 7，與西藏地區(qū)60 份野生草地早熟禾的遺傳相似系數(shù)（ISSR 法，GS 0.525 3～0.878 8）相近［10］，與國內(nèi)外的73 份草地早熟禾的遺傳相似系數(shù)（SSRs 法，GS 0.56～1 之間；SRAP 法，GS 0.53～0.99）亦相近［26］。總之，野生草地早熟禾種質(zhì)資源均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

與其它植物相比，同在山西地區(qū)，白羊草（Bothriochloa ischaemum）的遺傳相似系數(shù)為0.818 8～0.980 1、基因多樣性指數(shù)為0.172 3［27］，蒙古黃芪（Astragalus membranaceus）的遺傳相似系數(shù)為0.523 8～0.706 3［28］，糜子（Panicum milia?ceum）和青狗尾草（Setaria viridis）的基因多樣性指 數(shù) 分 別 為0.768 6 和0.660 0［29，30］。在 同 一 區(qū) 域，草地早熟禾的遺傳多樣性低于糜子和青狗尾草，高于白羊草，與蒙古黃芪相近。白羊草為多年生兼性無融合生殖草本植物；蒙古黃芪為多年生異花授粉草本植物；糜子為一年生自花授粉草本植物；青狗尾草為一年生自花授粉草本植物。由此推斷，一年生草本植物的遺傳多樣性高于多年生草本植物，具有無融合生殖特征的植物其遺傳多樣性低于有性生殖的植物。在采集范圍一定的前提下，植物的遺傳多樣性高低可能更多地受到本身生活史、交配系統(tǒng)和繁殖方式的影響，這與Hamrick 的研究結果一致［31，32］。

4 結論

根據(jù)本研究對山西地區(qū)10 個野生草地早熟禾居群（共計49 份樣品）進行的遺傳多樣性和遺傳結構的分析，山西地區(qū)不同草地早熟禾居群間基因多樣性水平存在較大差異，其中地理距離較近的野生居群間其遺傳相似性較高。山西地區(qū)野生草地早熟禾種質(zhì)資源具備較高的遺傳多樣性，49 份供試野生種質(zhì)資源樣品與人工育成的商品種‘愛美’間存在較大的遺傳距離。