李遠洋，李玉姍，王芳芝，余耀琨，曾靖雯

(肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061)

單胺氧化酶(MAO)主要分布在脊椎動物的大腦和肝臟中，單胺氧化酶有兩種亞型，分別為MAO-A和MAO-B，其中MAO-A是抗抑郁藥物研發(fā)的靶點之一。主要分布在兒茶酚胺能神經元中，使單胺類神經遞質失活。單胺氧化酶抑制劑通過抑制單胺氧化酶的對單胺類物質的氧化活性，達到減輕或者消除由各種原因引起的單胺類神經遞質減少或單胺氧化酶活性過高導致的疾病。

抑郁癥是現代患病率較高的精神疾病之一，成因復雜，藥物治療仍然是目前臨床最重要的治療方式，大多數抗抑郁藥都是基于增強體內單胺能神經傳遞濃度的基礎上研發(fā)的，如三環(huán)類抗抑郁藥物、單胺氧化酶抑制劑及選擇性五羥色胺再攝取抑制劑，前兩者藥物副作用較大，從天然藥物中尋找耐受性更好，更安全的藥物為治療抑郁癥提供了新的方向。

許多天然藥物揮發(fā)油被證實具有治療、緩解抑郁癥的效果[1-2]，例如迷迭香與檸檬草揮發(fā)油處理后的小鼠表現出行為性活躍有所恢復[3]，具有一定的抗抑郁作用。

本項工作中以MAO-A為靶點蛋白，應用DS分子模擬軟件，運用CDOCKER對接方法，在CHARMnm力場下進行靶點蛋白MAO-A與從天然藥物中選取的小分子配體的對接，研究天然藥物揮發(fā)油組分與靶點蛋白MAO-A的相互作用，為抗抑郁藥物苗頭化合物的發(fā)現與結構修飾提供思路。

1 實 驗

1.1 配體小分子的準備

根據文獻報導[3-4,6-12]，查得可能具有抗抑郁作用的揮發(fā)油主要成分12種：梨醇酯、芳樟醇、迷迭香酸、香葉木素、木犀草素、乙酸芳樟酯、薄荷酮、D-檸檬烯、松油醇、α-松油烯、β-細辛醚、α-細辛醚，通過DS直接構建天然藥物揮發(fā)油組分結構，或者利用ChemOffice[13]畫圖拷貝到DS?？紤]對映異構體、pH等因素，通過DS產生三維結構、加氫、產生異構體等。經過處理產生配體小分子，隨后依次利用DS中的Prepare Ligands，Full Minimization功能，對配體小分子進行結構及力場優(yōu)化處理，將處理后的小分子文件導出為PDB格式備用。

1.2 MAO-A受體蛋白的準備

PDB蛋白質結構數據庫是目前最主要的收集生物大分子(蛋白質、核酸和糖)2.5維結構的數據庫。

本研究選取MAO-A受體蛋白來自于RCSB數據庫(PDBID:2Z5X)，通過Discovery Studio軟件對數據庫下載的受體蛋白PDB文件進行去除水分子、原配體分子和蛋白分子加極性氫處理，最終得到所需MAO-A受體蛋白PDBQT文件。

1.3 對接環(huán)境準備

使用DS提取靶點蛋白MAO-A構象，去除多余氨基酸殘基，并保存為pdb文件，查閱相關文獻[1-8]，以蛋白空腔拓展為活性中心，SBD_Site_Sphere球體參數設置與對接驗證見表1，配體參數設置完成后均能與2z5x原配體肉葉蕓香堿成功對接，對接結果與文獻[15]同一數量級，驗證參數設置有效。

表1 Discovery Studio模擬對接中蛋白活性位點設置參數Table 1 Parameters of protein active site setting in Discovery Studio docking

1.4 小分子與受體蛋白模擬對接

分子對接是通過把配體分子放在受體活性位點的位置，然后按照幾何互補、能量互補以及化學環(huán)境互補的原則來實時評價配體與受體相互作用的強弱，并找到兩個分子之間最佳的結合模式。其中包括CDOCKER-精準分子對接、全柔性受體-配體對接、DS LibDock-快速的分子對接以及分子對接后的構象分析，本研究中選用CDOCKER-精準對接模式[17]模擬MAO-A與天然藥物揮發(fā)油成分小分子對接。

1.4.1 受體結合位點的選擇

定義結合位點對分子對接結果有直接影響，定義結合位點主要有三種方法，一是配體擴張法，即以原配體(共晶化合物)所在位置為活性中心擴張一定的范圍，此范圍內的氨基酸殘基則定義為活性位點；二是文獻檢索法，即通過文獻檢索找到已報道的活性位點來定義結合位點；三是軟件預測法，即通過DS軟件分析最有潛力的結合位點。

由于該蛋白有共晶化合物，因此本研究主要運用文獻檢索法與活性中心擴張法定義受體結合位點。設置原配體所在位置為活性中心，通過調整SBD_Site_Sphere球體半徑及位置，令球體的空腔即為活性位點。原則上，要保證球體將配體全部包裹，但球體大小不宜過大，否則會使不同的小分子對接至受體的其他位置造成結果偏移，球體的大小會直接影響對接結果。

1.4.2 精準分子對接技術(CDOCKER)

采用DS中的CDOCKER對接技術進行揮發(fā)油成分小分子與MAO-A受體蛋白模擬對接，CDOCKER是在CHARMm立場下產生高精度分子對接結果的技術。通過對電子(量子論)與原子(立場法)的比較，選用適用于生物大分子的模擬，計算量相對小10倍的分子立場法。在適當范圍內，該法較量子論計算方法的精準度相差無幾。DS中的CHARMm力場函數復雜度較低，精確度較高。函數關系如下：

Epot=Ebond+Eangle+Etorsion+Eoop→internal terms

+Eelec+EvdW→internal/external terms

+Econstraint+Euser→special

MAO A從PDB數據庫獲得，快速直接將蛋白質溶解在不同的pH值下，設置顯性溶劑環(huán)境，為避免原子受到較大的擾動而造成體系計算失敗(特別是體系升溫過程)。進行能量優(yōu)化消除蛋白結構內部蛋白質與水分子之間的一些觸碰及結構不合理區(qū)，同時采用PME法進行靜電處理。采用緩慢升溫(1ps升溫10 K)，即升溫過程選擇true，避免直接將體系溫度升高到較高的體系模擬的溫度時，體系內原子位移較大而計算失敗的現象。待體系經過一定時間達平衡后進行采樣。并從MD的采樣數據中預測二面角、RMSD、體系能量、勢能、氫鍵數量、配體受體氫鍵作用的變化。

首先對靶點蛋白，配體小分子進行結構及力場優(yōu)化處理，其次設置好活性位點，球體的坐標和半徑，Top Hits等參數后運行，進行精準分子對接。

1.4.3 分子對接構象結果分析

分子之間的非鍵相互作用是生命體系中分子識別的基礎，藥物設計的關鍵之一就是分析分子間的相互作用情況。DS中的對接結果報告將對接過程中的各種相互作用力總結表述，包括疏水、氫鍵、靜電以及其他作用，明確受體蛋白中的各種氨基酸殘基與配體小分子之間的相互作用的數目以及每一種相互作用類型涉及數目排行靠前的氨基酸殘基。

(1)配體-蛋白相互作用的二維平面圖生成

該平面圖可顯示受體蛋白氨基酸殘基與配體對接構型間的非鍵相互作用類型及距離等相關信息，便于我們更直觀的觀察兩者的相互作用及關鍵的氨基酸和基團，以便分析對接結果。

(2)作用類型熱圖生成

對接完成后打開DS中的Heat Map(Favorable)配體分子與受體蛋白之間的相互作用以熱圖的形式被展現出來。熱圖中包含了所有的對接構象及相對應的相互作用信息。

2 結果與討論

2.1 揮發(fā)油主要成分小分子與受體蛋白結合情況

通過DS中的CDOCKER精準分子對接技術模擬12種揮發(fā)油成分小分子與MAO-A受體蛋白模擬對接，對接結果中選取最優(yōu)對接構象，并對能量排序見表2。CDOCKER對接主要計算配體小分子與受體蛋白總能量(CDOCKER_ENERGY)，配體-受體相互作用能量(CDOCKER_INTERACTION_ENERGY)，以此兩種能量做對接情況的參考，CDOCKER_ENERGY越小，說明對接體系總能量低，對接體系穩(wěn)定，CDOCKER_INTERACTION_ENERGY越低，表示對接過程中相互作用小，兩者結合得越好。DS中對上述兩種能量數值取負數，故-CDOCKER_ENERGY越大，對接越穩(wěn)定， -CDOCKER_INTERACTION_ENERGY越大，配體與受體結合越好。取兩值之和并對其排序，可作為對接情況優(yōu)劣的參考依據。

表2 揮發(fā)油成分小分子與MAO-A對接結果Table 2 Docking results of volatile oil components and MAO-A

揮發(fā)油主要成分小分子均能與MAO-A對接成功，且與原配體肉葉蕓香堿相比較，有6種配體小分子對接結果較優(yōu)于原配體。其中前3種配體與受體蛋白結合二維平面圖如圖1～圖3所示。

圖1 木犀草素與MAO-A對接平面圖Fig.1 Figure of luteolin docking with MAO-A

圖2 香葉木素與MAO-A對接平面圖Fig.2 Figure of vanillin docking with MAO-A

圖3 迷迭香酸與MAO-A結合Fig.3 Figure of rosmarinic acid docking with MAO-A

2.2 天然藥物小分子與受體的各種作用力

配體分子與受體蛋白的各種作用力統(tǒng)計與各種作用數量前五的殘基計數見表3。

表3 全類型作用總計Table 3 Total Interaction count

對接過程中各種對接形態(tài)配體與受體蛋白中產生氫鍵作用的殘基共有258個，產生疏水作用的有562個，靜電作用的有42個，其中產生氫鍵數目排行前五的氨基酸殘基為：TYR69、TYR444、GLY67、ALA68 、TYR407；產生靜電相互作用的殘基數目排行前五的氨基酸殘基為：LYS305、ARG51、GLU216、TRP397、PHE352；產生疏水作用的殘基數目排行前五的氨基酸殘基為：TYR407、TYR444、ARG51、MET445、 CYS406。產生其他作用的殘基有CYS406與MET445。

對接中全部配體與受體產生的所有作用如圖4所示，可見各配體與氨基酸殘基互相作用數目熱度，其中互相作用熱度較高的有ARG51、TYR69、GLY66、TYR407等?？芍狹AO-A蛋白的活性空腔大致由上述殘基共同構成，且其中氨基酸殘基TYR407熱度較高，可知其在結合過程中是關鍵殘基[17]。

圖4 配體與受體相互作用熱圖Fig.4 Heat map of ligand-receptor interaction

2.3 數據評判標準

除DS中的對接結果中的能量數據之外，研究結果[17]表明MAO-A的活性中心結合的關鍵在于與氨基酸殘基Phe208、ASn181、Tyr407產生相互作用，而本研究選用的MAO-A(PDBID:2z5x)的原配體肉葉蕓香堿與氨基酸殘基Tyr407形成π-π堆積作用，也從一定程度說明了配體小分子與上述殘基的相互作用是配體小分子與受體蛋白活性中心結合的關鍵，故可從配體分子與殘基的作用情況與結合的數據結果分析配體小分子是否能與受體蛋白活性中心結合。根據結合作用熱圖可知，TYR407熱度較其他殘基更高，表明對接結果數據可靠。

3 結 論

本研究從已知的天然藥物揮發(fā)油成分中選擇可能具有抗抑郁成分12種，與受體蛋白原配體肉葉蕓香堿對比結果分析，共有6種對接結果得分高于原配體，天然藥物揮發(fā)油活性小分子作為抑制劑進入受體“口袋”形成空間位阻效應，最終抑制MAO-A，阻止腦內5-HT和NE降解，同時提升腦內突觸間隙5-HT和NE的濃度，起到一定的抗抑郁作用。

以本次對接結果中能量高低排序，得分較高的3種小分子為例：

木犀草素與MAO-A中的TYR407氨基酸殘基可產生T型的π-π堆積作用(Pi-Pi T-shaped)，與GLY66、TYR44、TYR69等氨基酸殘基構成的活性空腔相結合；

香葉木素環(huán)狀結構與MAO-A中的TYR407、TYR444產生π-π堆積作用，酚羥基與LYS305起Salt Bridge作用；

迷迭香酸中的環(huán)狀結構與殘基TYR69產生T型π-π堆積作用(Pi-Pi T-shaped)，兩個甲基與TYR407產生Pi-Alkyl作用。

就以上三種對接能量得分較高的配體小分子對接情況而言，均能與TYR407殘基產生π-π堆積作用，且能與關鍵氨基酸殘基構成的活性空腔良性結合，可能是其對接能量得分較高的原因之一。

研究中選用的12種小分子多數存在于天然藥物揮發(fā)油中，且來源并不單一，對接得分較高的幾種配體在臨床中抗抑郁活性有待進一步活體實驗驗證，對接得分不高的配體也可能通過其他途徑起抗抑郁作用，同樣能起到抗抑郁作用的受體蛋白還有多巴胺轉運體(DAT)、5-羥色胺轉運體(SERT)等，抗抑郁作用機制并非單一渠道，與MAO-A作用只是其中一種抗抑郁途徑，計算機模擬分子對接結果可為天然藥物揮發(fā)油抗抑郁研究提供理論導向，為抑郁癥新藥研發(fā)提供新的思路。